Реферат на тему: "Диалектика геномной коэволюции паразита и хозяина"

У нас на сайте представлено огромное количество информации, которая сможет помочь Вам в написании необходимой учебной работы.

Но если вдруг:

Вам нужна качественная учебная работа (контрольная, реферат, курсовая, дипломная, отчет по практике, перевод, эссе, РГР, ВКР, диссертация, шпоры...) с проверкой на плагиат (с высоким % оригинальности) выполненная в самые короткие сроки, с гарантией и бесплатными доработками до самой сдачи/защиты - ОБРАЩАЙТЕСЬ!

Введение

Диалектика есть учение о развитии через противоречия (Ильенков, 1957). Эта философская концепция постулирует, что в любом сложном объекте, будь то организм, звезда, биосфера Земли или человеческое общество, имеют место противоположные тенденции, взаимные переходы между различными и противоположными состояниями составляющего его вещества, или конструктивные противоречия между разными функциями в рамках одного элемента. При этом важно чтобы объект имел долгую эволюционную историю, которая отражалась бы в нынешнем строении объекта. Развитие объекта, с одной стороны, есть процесс непрерывного накопления количественных различий между этими противоположными составляющими, а с другой стороны – состоит из последовательных качественных скачков.

В законченном виде диалектическое учение было представлено Г.В.Ф. Гегелем в работе «Наука Логики» (Гегель, 1970) и впервые научно применено К. Марксом к критическому исследованию капиталистического общества в работе «Капитал» (Маркс, 1867). Диалектический метод позволил основным выводам Маркса оставаться актуальными не только на момент Октябрьского переворота 1917 года (Ленин, 1917), но и в значительной мере в XXI веке (Komolov, 2015, Harvey 2017). В настоящее время, в частности, остается справедливым тезис Маркса о снижении капиталистической прибыли при внедрении машинного производства и повышении производительности труда, которое неизбежно приведет к «социализации» крупных монополий в интересах абсолютного большинства трудящихся и к долгосрочному планированию производства (Комолов, 2016).

Помимо политэкономии, диалектический подход применялся и к естественным наукам. Принципы этого применения были описаны Ф. Энгельсом в незаконченной книге «Диалектика природы» (Энгельс, 1934). В частности, была вскрыта диалектическая природа эволюционных процессов, например, происхождения человека. Яркий пример диалектической модели – эволюция звезды, которая происходит под влиянием баланса противоположных сил давления слоев газа и давления излучения звезды. При этом основные стадии в развитии звезды главной последовательности, от формирования звезды из облака межзвездного газа до красного гиганта и белого карлика, сменяются путем возникновения временных дисбалансов между этими двумя противоположными силами (Lequeux, 2013).

Эволюция геномов происходит сложным и во многом диалектическим образом. В любом геноме, особенно в геномах позвоночных, есть крупные ансамбли генов и других последовательностей, изменяющихся противоположным образом и противоположным образом влияющих на организм в целом в ходе своей экспрессии, а у многих генов есть противоречащие друг другу функции (Кунин, 2018). Один из центральных вопросов геномной эволюции – «гонка вооружений» между хозяином (белок-кодирующими генами в геноме) и геномными паразитами, такими как вирусы, транспозоны, интроны и прочие «эгоистичные генетические элементы» (Koonin, 2020). В процессе этого диалектического взаимодействия возникли многие революционные изменения уровня сложности живых систем – от эукариотических клеток до позвоночных с адаптивной иммунной системой (Кунин, 2018). В данной работе рассматривается диалектическая природа коэволюции паразитов и хозяина, а также основные революционные изменения, которые происходили в ходе эволюционной истории живых организмов во многом под влиянием этой «гонки вооружений» и привели к появлению живых систем принципиально нового уровня сложности.

Геномные паразиты и хозяева – разные «классы» эгоистичных генов

Геном живого организма - это ансамбль генов, связанных с ними регуляторных участков, обеспечивающих их работу и прочих последовательностей ДНК, таких как центромеры, теломеры и разного рода повторяющиеся последовательности. Гены кодируют РНК и белки, которые выполняют определенные функции, связанные с выживанием и размножением организма как целого. В книгах «Эгоистичный ген» и «Расширенный фенотип» известный зоолог и популяризатор науки Р. Докинз продемонстрировал, что все функции генов сводятся лишь к обеспечению их удвоения в максимальном числе копий, и можно говорить о наличии у данной последовательности ДНК «интереса», связанного с копированием тем или иным способом (Dawkins, 1989). Причем функции генов могут быть очень опосредованным образов связаны с их эволюционным интересом, например, гены, ответственные за яркую окраску хвоста павлина не повышают общую безопасность организма, а только мешают спасаться от хищников. Но за счет популярности у самок именно роскошных хвостов экспрессия этих генов все-таки увеличивает число их копий в следующих поколениях.

В многоклеточных организмах не все клетки передают свои гены для размножения, в этом участвует только специализированная половая линия, дающая яйцеклетки и сперматозоиды. Такое «разделение труда» вкупе с идентичностью геномов разных клеток в организме (за некоторыми исключениями, такими как часть клеток иммунной системы у позвоночных) позволяет естественному отбору «приводить» функции отдельных генов к совместному функционированию, которое и обеспечивает согласованность функций отдельных клеток и тканей в организме. Интересно, что при нарушении правила об идентичности геномов клетки начинают функционировать во вред организму как целому, что происходит, например, при раке, когда возросшая частота мутаций приводит к запуску эволюции внутри отдельных тканей, формированию раковых опухолей, метастаз и гибели организма (Motofei, 2018).

Помимо «собственных» генов, в геномах большинства организмов присутствуют последовательности, которые увеличивают число своих копий без посредства полового размножения, а другими способами. К таким последовательностям относятся вирусы, транспозоны, интроны, плазмиды и прочие геномные «паразиты» (Koonin & Dolja, 2017). Размножаются и переносятся они как внутри генома из одной локации в другую путем транспозиции (Hyckman &Dyda, 2015) и от одной клетки (организма) к другой путем горизонтального переноса генов (Lang et al. 2017), самый простой пример последнего – заражение вирусами новых хоязев. В результате эти «паразиты» подвержены отбору совершенно иного качества, чем «аутентичные» гены организма: они не способствуют максимизации числа копий последних через половое размножение (или деление для одноклеточных организмов), поэтому могут быть вредны для протекания некоторых процессов и стадий жизненного цикла организма-хозяина (Dawkins, 1989). Зато они могут перенаправлять метаболические и информационные процессы хозяина таким образом, чтобы способствовать собственной репликации, и тем самым вредить жизненному циклу хозяина. Более того, такие радикальные отличия жизненного цикла паразитов от жизненного цикла хозяина приводят к различной скорости эволюционных изменений в результате взаимодействия с клеточными системами репарации и экспрессии (Hurst &Magiorkinis, 2017). Так же примечательно, что правило об идентичности геномов разных клеток многоклеточного организма (разумеется, с учетом неизбежных случайных мутаций) в некоторых случаях нарушается. Организмы прибегают к внесению контролируемого разнообразия в клеточные геномы, например, при рекомбинации генов антител в адаптивной иммунной системе позвоночных, и это связано с работой геномных паразитов, а не только хозяев (Hiranoet al. 2011). Это – один из многих примеров конструктивного взаимодействия геномных паразитов и клеточных генов.

Таким образов, в геномах большинства организмов присутствуют две группы генов с различными эволюционными «интересами»: 1) собственно клеточные гены, которые кооперируются и участвуют в размножении организма как целого и 2) геномные паразиты, которые максимизируют число своих копий иными путями и перенаправляют метаболические и информационные процессы, катализируемые генами первой группы, для собственного размножения. Существующее разнообразие организмов, их структур и функций во многом является продуктом диалектического взаимодействия этих «классов» генов. Тем не менее, важно понимать, что между клеточными генами и геномными паразитами есть непрерывное множество переходных форм по критерию близости жизненного цикла данного паразита с конвенциональным размножением организма как целого (Koonin, 2016). Если хозяина в чистом виде встретить можно (тот же ген гемоглобина), то едва ли можно найти «чистого паразита», которому по идее должно быть выгодно полное уничтожение организма-хозяина.

Вирусы и клетки возникли совместно

Согласно одной из наиболее признанных моделей происхождения жизни, первые клетки возникли в пористых минералах, богатых сульфидом железа и цинка, расположенных на поверхностных геотермальных полях, освещаемых солнцем. Ультрафиолетовое излучение, богатая углекислым газом атмосфера и природный катализатор в виде сульфида цинка позволил, вероятно, осуществить первый абиогенный фотосинтез и сформировать первые углерод-содержащие биополимеры (Mulkidjanian, 2007). Возникшие в результате абиогенного синтеза первые самореплицирующиеся молекулы РНК (и, возможно, других нуклеиновых кислот) и стали первыми генами, которые сформировали первые клеточные структуры.

Но как, и, что важнее, за счет каких эволюционных сил возникли первые клетки? РНК-репликаторы и связанные с ними белки на первых этапах биологической эволюции не нуждались в полупроницаемой мембране, которая бы изолировала внутреннюю среду клетки от внешней, отличной по химическому составу, так как первые биологические макромолекулы функционировали в микропорах сульфидных минералов, в которых необходимая концентрация простых мономеров могла поддерживаться и абиогенным путей за счет температурных градиентов и явления термофореза (Niether et al., 2016). Однако вычислительные эксперименты показывают, что в системе репликаторов (самокопирующихся молекул, прототипов генов), которые кодируют белки или иные продукты, необходимые для их копирования, и кооперируются друг с другом (то есть для копирования каждого гена необходимы продукты многих других генов) неизбежно возникновение паразитов, то есть таких репликаторов, которые не кодируют никаких полезных белков, зато эксплуатируют машины репликации для собственного копирования (Koonin, 2014). В этой связи возникновение клеточной мембраны, поверхностных белков и возникновение собственно клетки происходит неизбежно под давлением естественного отбора «кооперативных» репликаторов, которые таким образом защищаются от «эгоистичных» репликаторов, а те, в свою очередь, заимствуют поверхностные белки клетки для построения оболочки, проникновения в первые клетки и переноса между разными клетками (Koonin, 2014; Krupovic et al., 2019). Иными словами, развитие клетки было обусловлено противоречиями разных эволюционных «интересов» в системе доклеточных репликаторов.

Но откуда могли возникнуть противоречия между разными репликаторами? Мы видим, что возникновение первых репликаторов (прототипов генов) произошло, по всей вероятности, в виде большого доклеточного «пула» разнородных генетических элементов (Koonin et al., 2006), «обитавших» в микропорах сульфидных минералов (Mulkidjanian, 2007). При этом копировалась развернутая в линейную конформацию рибонуклеотидная матрица этих генетических элементов, тогда как за функцию отвечал белковый продукт (или обладающая специфической вторичной и третичной структурой РНК). Важно, что структура и нуклеотидная последовательность матрицы систематически никак не связана с функцией ее продукта. Иными словами, в доклеточной системе репликаторов не было механизма, который бы обеспечивал процесс репликации данной молекулы РНК именно ее продуктом, и обратно: продукт данной молекулы РНК мог катализировать репликацию других молекул РНК. В результате этого реплицироваться могут те РНК, которые не участвуют в кодировании компонентов машин репликации. Это противоречие, отсутствие жесткой связи между репликатором и его продуктом и порождает конфликт интересов разных репликаторов, приводит к появлению паразитов и последующей эволюции клеточной мембраны и собственно клетки.

С другой стороны, противоречие между последовательностью молекулы РНК и функцией ее продукта могло быть решено путем возникновения очень длинной молекулы РНК, которая бы копировала только «сама себя» и не занималась бы копированием посторонних молекул. Однако эта модель несостоятельна по причине недостаточной информационной емкости такой молекулы. Иными словами, для достаточно точного копирования (среднее число ошибок менее 1 на копию) молекулы РНК данной длины нужна молекула РНК большей длины, как было показано в 70-х годах химиком М. Эйгеном (Eigen, 1971). Поэтому неизбежно возникает ансамбль кооперирующихся репликаторов, первичный синтез которых происходит под влиянием абиогенных сил, таких как ультрафиолет, температурные градиенты, неорганический катализ (Никитин, 2016). И в этом ансамбле так же неизбежно за счет внутренних противоречий между последовательностью репликатора и функцией его продукта возникает дифференциация на «классы» с противоположными интересами: кооперирующиеся репликаторы и репликаторы-паразиты. В свою очередь, эти противоречия снимаются через развитие клеточной структуры, которая позволяет исключить паразитов за пределы клеточной мембраны. Важно, что это развитие напрямую стимулируется накопленными противоречиями, тогда как система репликаторов в целом переходит на новый уровень сложности. Как мы увидим в дальнейшем, такое диалектическое взаимодействие паразита и хозяина продолжается и в клетке, которая развивает многочисленные способы борьбы с проникающими внутрь вирусами, тогда как вирусы «изобретают» средства обходить системы защиты.

Важно то, что в таком диалектическом свете репликаторы очень похожи на определение товара у Маркса. В самом деле, в первом томе «Капитала» (Маркс, 1867) Маркс выделяет две фундаментальных категории у товара: потребительную стоимость и стоимость, где первая это способность товара удовлетворять потребности людей, а вторая – издержки производства, или общественно необходимое рабочее время производства товара. Аналогично последовательности и продукту репликатора, потребительная стоимость и стоимость не связаны друг с другом механистически: полезное свойство товара ничего не говорит наблюдателю о количестве труда, затраченного на его производство. По Марксу, такое противоречие между потребительной стоимостью и стоимостью рождает необходимость товара-универсального эквивалента стоимости, то есть денег, которые, в свою очередь, также внутренне противоречивы. В дальнейшем по ходу исторического развития противоречия товарно-денежной системы рождают капитал и наемный труд, которые через классовую борьбу приводят к развитию общества и переходу его на качественно новую ступень развития. В случае же с репликаторами, противоречия последовательности и продукта ведут к возникновению репликаторов-паразитов и кооператоров и к возникновению клетки, а в дальнейшем и более сложных систем.

Итак, налицо развертывание диалектического противоречия, заложенного в основе (репликатор или товар), приводящее к усложнению системы (возникновение клетки, развитие капиталистического общества). В дальнейшем будет показано, что диалектическая природа феномена «гонки вооружений» паразита и хозяина проявляется и в других эволюционных процессах.

Хозяин борется с паразитом

В ходе эволюции организмы-хозяева «выработали» разнообразные средства защиты от патогенов. Обычно белки или нуклеиновые кислоты патогена отличаются по своей структуре и химическим компонентам от макромолекул хозяина, что неизбежно вытекает из важных отличий жизненного цикла патогена от жизненного цикла хозяина. Например, малый размер генома приводит к тому, что оболочка вируса (капсид) строится из одного-нескольких белков, которые самособираются в квазисимметричную структуру (например, икосаэдра или более сложных тел, состоящих из правильных пятиугольников и шестиугольников). Такой способ сборки может приводить к эволюции особого типа белковых доменов, не встречающихся у клетки-хозяина. А для выявления этих специфических доменов клетка может развить белки-рецепторы, сигнализирующие о появлении вируса и запускающие иммунный ответ.

Одна из самых простых систем – рестрикция-модификация, распространенная у многих бактерий. Здесь клетка использует для защиты всего два гена: первый кодирует сайт-специфическую нуклеазу, которая называется рестриктазой. Этот фермент разрезает ДНК по четко определенным мотивам – коротким последовательностям ДНК, 4-8 нуклеотидов в длину. Второй кодирует фермент, который вносит ковалентные модификации в ДНК по тем же коротким последовательностям, делая их непригодными для внесения разрезов рестриктазой (Wilson, 1991). В результате те участки, которые есть в геноме хозяина и могли бы расщепляться рестриктазой, защищены от ее действия модификацией, а новая ДНК вирусов и прочих паразитов, поступающая в клетку, не защищена от расщепления и уничтожается до того, как причинит клетке существенный вред. Такая простая система используется клетками не только для защиты от геномных паразитов, но и для регуляции разнообразных клеточных процессов, например, клеточного цикла и деления у кишечной палочки (Reisenauer et al., 1999).

Один из наиболее распространенных способов защиты у прокариот и у эукариот – РНК-интерференция. Система основана на белках (например, белок Dicer), которые распознают двуцепочечные РНК, возникающие в ходе репликации генома многих вирусов. В дальнейшем эти РНК расщепляются на короткие одноцепочечные фрагменты, и другая система белков, называемая Argonaute, занимается поиском всех нуклеиновых кислот, обладающих определенным сходством с фрагментами исходной РНК, и расщеплением их (Mello & Conte, 2004). РНК-интерференция распространена во всех основных группах живых организмов, от бактерий до многоклеточных животных, и в разных группах организмов на канонический путь РНК-интерференции накладываются дополнительные защитные механизмы: РНК-направляемое метилирование ДНК и ее последующая эпигенетическая инактивация, программируемые перестройки генома, исключение ДНК, имеющей отношение к геномным паразитом, из мейоза и полового размножения (Cerutti & Casas-Mollano, 2006). Интересно, что у общего предка эукариот помимо системы детекции двуцепочечных РНК и расщепления похожих на них нуклеиновых кислот есть еще РНК-зависимая РНК-полимераза (Cerutti & Casas-Mollano, 2006) – фермент, заимствованный у вирусов и способный синтезировать РНК-копию на РНК-матрице. Благодаря этому, системы РНК-интерференции у многих эукариот способны пополнять набор коротких РНК, по которым осуществляется поиск потенциальных нуклеиновых кислот вирусного происхождения. Более того, РНК, часть которой распознана как имеющая вирусное происхождение, может вся расщепляться на новые короткие РНК, используемые для выявления новых паразитов. Так происходит у плодовой мушки Drosophila melanogaster в системе piРНК (Sarkar et al., 2017). Наконец, как piРНК, так и другие короткие интерферирующие РНК часто используются в регуляции собственных генов хозяина, когда их необходимо «выключить» (Sarkar et al., 2017). Такая тесная связь систем защиты хозяина от паразитов и заимствований от этих же паразитов аналогична отсутствию чистых форм в диалектике: инструмент борьбы с паразитами редко используется только по назначению, неизбежно возникают дополнительные функции, которые он мог бы исполнять, и эти «функциональные ниши» быстро заполняются эволюцией. Показательно, что отдельный класс коротких РНК, микроРНК, вовлечены практически во все процессы развития и патогенеза у животных, они транскрибируются с генов, которые не имеют никакой видимой связи с вирусами или транспозонами, и их нарушения могут приводить к различным болезням, например, к раку у человека (Ha & Kim, 2014).

Другой известный механизм борьбы с паразитами, система CRISPR-Cas, найден в отличие от РНК-интерференции только у прокариот. Эта система основана на специальных повторах в геноме, в которые встраиваются фрагменты всех новых нуклеиновых кислот, поступающих в клетку. Далее с этих повторов в геноме снимается РНК-копия и разрезается на короткие РНК, которые, как и короткие интерферирующие РНК, служат «гидом» для расщепления всех нуклеиновых кислот в клетке, которые имеют с этими гидовыми РНК определенное сходство. Таким образом, CRISPR-Cas это адаптивная иммунная система, направленная против вирусов-бактериофагов, уничтожающих клетки прокариот (Hille et al., 2018). В геномных повторах CRISPR хранится информация о прошлых инфекциях клетки бактериофагами, благодаря чему она обладает приобретенным иммунитетом к новым инфекциям этими фагами: поступающая внутрь фаговая ДНК сразу же расщепляется специальными белками-каспазами. Как и в РНК-интерференции, система CRISPR-Cas работает с множеством надстроек, обеспечивающих выбор в первую очередь чужеродных, фаговых последовательностей, а не клеточных, для встраивания в систему повторов (Sternberg et al., 2016). Еще более примечательно то, что совершенно аналогичная система независимо возникла у инфузорий. Эта система, названная IES-Ias, распознает чужеродную ДНК аналогично белкам РНК-интерференции, однако система удаления этой ДНК возникла из совершенно не связанных с адаптивным иммунитетом белков (Swart & Nowacki, 2015). Это – еще одно подтверждение диалектических принципов коэволюции патогена и хозяина, согласно которым в сходных условиях «борьбы интересов» из различных молекулярных компонентов возникают системы аналогичного действия.

Помимо иммунных систем, действующих на нуклеиновых кислотах, есть и белковые иммунные системы, не использующие принцип матричного синтеза нуклеиновых кислот и распознавания чужеродной нуклеиновой кислоты по принципу комплементарности с гидовой РНК. Самый простой и распространенный тип – врожденный иммунитет, то есть белковые системы, которые распознают те или иные консервативные черты вирусных макромолекул, и затем расщепляют их или «передают» другим иммунным системам, например, РНК-интерференции. Так, у человека есть семейство из 13 генов TLR, каждый из которых распознает специфический патоген-ассоциированный молекулярный паттерн, например, липополисахарид (специфическая поверхностная молекула грам-отрицательных бактерий), муреин (компонент клеточной стенки бактерий), двуцепочечную РНК и т. д. (Takeda & Akira, 2015). Помимо иммунных процессов, TLR запускают также многие процессы развития, и эта двойная роль присуща TLR со времени происхождения многоклеточных животных (Brennan & Gilmore, 2018). Помимо уничтожения паразита, белки врожденного иммунитета занимаются эпигенетической репрессией (подавлением) тех вирусов и транспозонов, которые уже встроились в геном хозяина. Например, самое большое семейство факторов транскрипции позвоночных KRAB-ZFP занимается репрессией транспозонов, распознавая их последовательности по коротким консервативным участкам. Это семейство постоянно эволюционирует, чтобы «успевать» блокировать постоянно эволюционирующие транспозоны. И как обычно, эти белки участвуют в регуляции собственных генов клетки (Ecco et al., 2017).

После распознавания патогена TLR и другие белки-рецепторы врожденного иммунитета запускают адаптивный иммунный ответ. У млекопитающих адаптивный иммунный ответ основан на иммуноглобулинах, или антителах. Это белки, который способны узнавать различные чужеродные молекулы и вызывать определенный ответ на их внедрение. Антитела синтезируются В-лимфоцитами, при этом в ходе развития в геноме каждого В-лимфоцита происходят перестройки, которые дают различные варианты антиген-узнающего домена антитела. В результате каждый В-лимфоцит синтезирует строго определенный, единственный вариант антиген-узнающего домена на своих антителах. В-лимфоциты подвергаются отбору на способность синтезировать правильно собранные антитела, которые при этом не узнают собственные белки организма. Появление нового антигена в организме приводит к отбору тех В-лимфоциов, которые способны его распознавать, и синтезу большого количества антител, специфичных именно к этому антигену. По аналогии с остальными системами защиты от патогенов, здесь также наблюдается большое количество надстроек. Помимо В-лимфоцитов есть еще и Т-лимфоциты, которые также имеют вариабельные рецепторы антигенов, но занимаются подавлением внутриклеточных вирусных инфекций и регуляцией В-клеток. Более того, есть еще множество клеточных типов, занимающихся врожденным иммунитетом, ответом на специфические патогены и удалением аутоиммунных Т- и В-клеток (Herwald & Egesten, 2017).

Итак, мы видим большое разнообразие систем защиты от патогенов, возникающих независимо в различных эволюционных линиях, но в сходных условиях. Естественно, такое разнообразие иммунных систем порождает адекватные средства противодействовать им, ведь, по диалектике, любое действие рождает противодействие, оно не может быть односторонним.

Паразит «обходит» защитные системы хозяина

На большинство защитных систем хозяина геномные паразиты в ходе эволюции развивают тот или иной адекватный ответ, позволяющий им защищаться от разрушающего действия этих защитных систем. Интересно, что у прокариот, у которых наиболее активно происходит горизонтальный перенос генов (Lang et al. 2017), распространены такие схемы как перенос части генов защитной системы в геном бактериофага, так что при инфекции эти гены атакуют защитную систему хозяина. Так, моногие бактериофаги кодируют анти-CRISPR-белки, которые ингибируют клеточную систему CRISPR-Cas (Stanley & Maxwell, 2018), благодаря чему в долгосрочной перспективе горизонтальный перенос генов у прокариот не снижается значительно из-за препятствий, создаваемых этой адаптивной иммунной системой (Pawluk et al., 2018). Аналогичная система белков-ингибиторов позволяет многим РНК-вирусам избегать РНК-интерференции в клетках хозяина (Li & Wang, 2018). Более того, сам жизненный цикл этих вирусов использует такие механизмы репликации генома вируса, которые наименее подвержены действию систем РНК-интерференции хозяина (Aguado et al., 2018).

Способ защиты бактериофагов от систем рестрикции-модификации очень простой: патоген модифицирует свою ДНК таким образом, что защитные ферменты клетки не могут ее распознать как ДНК и расщепить. Известно множество типов модификаций фаговой ДНК, которые делают ее устойчивой к расщеплению клеточными защитными ферментами (Huang et al., 1982). Кроме того, многие модификации позволяют фагам добиться устойчивости к более сложным защитным системам клетки, таким как CRISPR-Cas (Bryson et al., 2015). Помимо модификаций собственной ДНК, бактериофаги приобретают устойчивость к рестриктазам и другим ферментам клетки, распознающим специфическим участки ДНК, путем постоянных мутаций, благодаря чему эти специфические сайты очень редки в геномах фагов (Pleška & Guet, 2017). Наконец, важно отметить, что сами системы рестрикции-модификации, предположительно, изначально возникли у геномных паразитов как частный случай системы яд-противоядие: паразитическая молекула ДНК кодирует долгоживущий яд для клетки и короткоживущее противоядие, в результате чего если клетка тем или иным способом избавится от этой ДНК, противоядие не будет больше синтезироваться и яд погубит клетку (All et al., 2017). Таким образом, клетки заимствуют системы защиты от паразитов и паразиты заимствуют их от клеток, «приручая» под свои цели – этот взаимный переход одной противоположности в другую является лейтмотивом геномной эволюции защитных систем, он подтверждается на широкой выборке прокариот с секвенированными в настоящее время геномами (Koonin et al., 2017) и, что самое главное, является полной аналогией диалектического принципа единства, взаимного перехода и борьбы противоположностей.

Несмотря на то, что адаптивный иммунитет позвоночных позволяет оперативно вырабатывать иммунный ответ на произвольного нового патогена с помощью антител и Т-клеточных рецепторов, этот качественный скачок не позволяет окончательно побороть патогенов. Колоссальное разнообразие видов микроорганизмов, проживающих в полости желудочно-кишечного тракта и в других локализациях организма, позволяет и патогенам быстро эволюционировать и «изобретать» новые способы «взлома» иммунной системы (Bliven & Maurelli, 2016), благодаря чему эволюционная гонка вооружений не прекращается, а только переходит на новый уровень. Яркий пример принципиально новых способов обхода адаптивной иммунной системы – постоянная и регулируемая смена поверхностных гликопротеинов у трипаносом, паразитических простейших, вызывающих смертельное заболевание африканскую сонную болезнь. Благодаря этому выработанный адаптивный иммунитет оказывается неэффективный после каждой смены гликопротеинов, в результате чего болезнь практически не лечится (Barry & McCulloch, 2001).

Наконец, вирусы и транспозоны сами вырабатывают защитные системы, ограничивающие собственное распространение в геноме хозяина и препятствующие проникновению новых паразитов. Так, классический объект микробиологии и вирусологии бактериофаг лямбда, инфицировав бактерию и встроившись в ее геном, запускает систему белков, которые не позволяют другим «особям» бактериофага сделать то же самое (Gandon, 2016). Другой пример – выбор точек встраивания в геном ретротранспозонами и ретровирусами эукариот, который определяется балансом между минимизацией повреждений для хозяина и максимизации уровня экспрессии участка генома, в который встроился паразит, в результате чего возникает большое разнообразие эволюционных стратегий встраивания (Sultana et al., 2017). В итоге для систем защиты хозяина от патогенов возникает возможность заимствования систем самоограничения самих патогенов, что дает дополнительный источник разнообразия этих систем защиты.

Таким образом, эволюционная гонка вооружений выступает ярким примерно диалектической основы эволюции жизни в целом. Если диалектическая связь генотипа и фенотипа, последовательности нуклеотидов и ее функции, развертывается в противоборстве паразита и хозяина, то развитие систем защиты хозяина от патогена и систем взлома этой защиты также протекает в диалектическом единстве, с большим количеством взаимных переходов. Возникновение защитных систем принципиально нового уровня, таких как адаптивная иммунная система позвоночных, не снимает противоречий, а лишь переводит их на новый уровень. В дальнейшем мы увидим, что и сами переходы жизни на новые уровни организации возникают в результате разворачивания этих противоречий.

Революционные изменения уровня сложности жизни как продукт коэволюции, «классовой борьбы» паразита и хозяина

Итак, мы показали, что геномы эволюционируют во многом под влиянием внутренних противоположных сил – экспансии геномных паразитов и развития защитных систем хозяина, а эти противоположные силы возникают как результат диалектической связи генотипа и фенотипа (последовательности и функции) уже у отдельных самореплицирующихся молекул РНК. В то же время диалектика учит, что небольшие количественные изменения этих внутренних противоборствующих сил могут приводить к качественному преобразованию всей системы, к фазовому переходу, к революции. Иными словами, развитие сложной системы (особенно генома в его длительной эволюционной истории) часто идет не только эволюционно, но и революционно, с радикальной перестройкой регуляторных систем генов, структуры генома, органелл клетки и клеточного строения в целом. Далее мы рассмотрим примеры таких революций.

Происхождение ДНК и клетки. Мы показали, что клеточная организация жизни, по-видимому, возникла в результате диалектических противоречий генов-паразитов и генов-кооператоров. В настоящее время имеются доказательства того, что клеточная организация возникла независимо несколько раз, последний универсальный общий предок жизни состоял из многих вирус-подобных генетических элементов и не имел клеточной структуры, и две единственные линии клеточной жизни на данный момент – бактерии и археи (Koonin, 2009). Так, у бактерий и архей различная биохимическая структура мембран и ферменты биосинтеза липидов, а также геномы и бактерий, и архей имеют такую структуру, как будто бы они возникли в результате агрегирования множества независимых генетических элементов (Koonin, 2009). Но что еще более интересно, у бактерий и архей отсутствует гомология ферментов репликации ДНК, что свидетельствует в пользу независимого происхождения ДНК-геномов (Koonin, 2009). Мы видели, что с целью избегания защитных систем хозяина, вирусы модифицируют свои геномы (Huang et al., 1982). ДНК могла быть такой же модификацией, «изобретенной» первыми вирусами под давлением отбора на избегание защиты первых РНК-клеток и дающей селективное преимущество для самих клеток в условиях давления паразитов (Takeuchi et al., 2011). В то же время ДНК, как молекула, способная сохранять информацию и служить матрицей лучше, чем РНК, взяла на себя роль генетического материала, тогда как РНК стала посредником в реализации генетической информации при синтезе белка, а также продолжила выполнять каталитические функции. В итоге возникновение ДНК позволило живым организмам увеличить размер генома, так как ДНК менее подвержена мутациям и позволяет геному большего размера стабильно реплицироваться со средним числом ошибок на геном за репликацию менее 1 (Eigen, 1971). Это, в свою очередь, позволило изолированным репликаторам агрегировать в единый геном, находящийся внутри одной клетки, что дало возможности жизни эволюционировать на совершенно ином уровне сложности, на клеточном уровне.

Происхождение эукариот. Сценарий происхождения ядерных организмов, эукариот, представляет задачу едва ли более сложную, чем происхождение первых клеток. В самом деле, эукариотические клетки в среднем в десятки раз превышают прокариотические по размерам, они имеют гораздо более сложный геном, состоящий из нескольких хромосом и заключенный в ядро со сложным комплексом ядерных пор и двумембранной оболочкой. Вдобавок, внутри всех (за исключением вторичных потерь) эукариотических клеток имеются митохондрии, по уровню сложности сопоставимые с прокариотическими клетками. Наконец, эукариоты имеют сложную систему цитоскелета и мембранного транспорта. Тем не менее, в настоящее время складывается картина, имеющая серьезные эмпирические подтверждения (Rogozin et al., 2012). В соответствии с этой моделью, ключевой движущей силой такого радикального усложнения клеток была экспансия особой группы геномных паразитов, так называемых автосплайсирующихся интронов. Эти геномные паразиты встраиваются в геном, а после синтеза РНК-копии гена, в который они встроились, РНК паразита вырезается и встраивается в новый участок генома хозяина. При этом для вырезания необходим синтез специального белка, обратной транскриптазы, с РНК паразита, которая находится внутри клеточной РНК и препятствует синтезу клеточного белка. Экспансия этих интронов была запущена тогда, когда у архейной клетки появился эндосимбионт-бактерия, от которой произошли митохондрии. Внутри генома эндосимбионта обитали интроны, чья экспансия была ограничена защитными системами клетки. Когда интроны попали в геном архейного хозяина, их экспансии не могли воспрепятствовать внутренние защитные системы, так как они не были «эволюционно заточены» именно под интроны (Koonin, 2006). В результате геном хозяина оказался замусорен интронами (что наблюдается у многих эукариот и по сей день), фрагментирован на хромосомы (концы которых поддерживаются с помощью теломеразы, которая произошла от обратной транскриптазы интронов), и белки клетки стали массово синтезироваться с нарушениями в результате встроек интронов, благодаря чему возник сильный отбор на создание собственной клеточной системы вырезания интронов и ядерной оболочки, которая позволяла бы отделить вырезание интронов из клеточной РНК от синтеза белка на ней (Rogozin et al., 2012). Происхождение эукариот (как и происхождение клеток и ДНК-геномов) - яркий пример революционных изменений, когда сдвиги в «балансе сил» между геномными паразитами и хозяином приводят к резкой экспансии паразитов, к резкому изменению давления естественного отбора, к усилению «гонки вооружений» и в конечном итоге к появлению эволюционного новшества (ДНК, клетка, ядерная оболочка), благодаря которому жизнь переходит на принципиально новый уровень сложности (Wagner, 2011).

Адаптивная иммунная система позвоночных. Эта эволюционная инновация имела более локальные последствия для жизни в целом, но колоссальный эффект для развития разумной жизни. В самом деле, адаптивная иммунная система позволяет развивать долгосрочный вторичный иммунитет (Guan & Qi, 1995) на произвольную инфекцию, что позволяет значительно повысить время жизни и размер организма, так как с ростом размера тела неизбежно возникает больше инфекций. Современные исследования показывают, что адаптивный иммунитет возник на базе клеточных систем врожденного иммунитета (Boehm & Swann, 2014), однако принципиальная инновация, рекомбинация генов Т- и В-клеточных рецепторов, которое дает фенотипическое разнообразие Т- и В-клеток и в конечном итоге формирование приобретенного иммунитета – эта инновация возникла путем комбинирования транспозонов и их ферментов, то есть возникла в результате взаимодействия геномных паразитов и хозяина (Koonin & Krupovic, 2015). Более того, аналогичная по принципу система рекомбинации возникала как минимум два раза, у челюстных и бесчелюстных позвоночных (Flajnik, 2018). Подобно происхождению системы CRISPR-Cas, здесь мобильные элементы предоставляют ферменты-инструменты перестройки генома, что позволяет достичь хозяину (вместе с паразитами) нового уровня сложности.

Плацента млекопитающих. Развитие плаценты – сравнительно недавний пример диалектического взаимодействия паразитов и хозяина, но очень важный для происхождения плацентарных млекопитающих. Известно, что многие белки, ответственные за развитие плаценты, например, синцитины, управляющие слиянием клеток во внешнем слое плаценты, некоторые транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов в плаценте, и иммуносупрессорные белки произошли от эндогенных ретровирусов, вида геномных паразитов (Denner, 2016). По некоторым моделям, плацента возникла у млекопитающих в результате возросшей активности вирусов, встроившихся в геном, или эндогенных ретровирусов (Villarreal, 2016).

Заключение

Мы показали наличие фундаментальных, антагонистических сил в геномной эволюции. Эти силы проявляются уже на этапе отдельных РНК-репликаторов, во многом запустили формирование клеточной структуры и происхождение эукариот, и на каждом из новых этапов эволюции жизни эти противоречия не снимаются, а лишь переходят на новый уровень. Несмотря на всеобъемлющую объяснительную и предсказательную силу такой диалектической модели эволюции, надо понимать, что эволюция может протекать не только под влиянием диалектического взаимодействия паразитов и хозяина. Например, развитие человеческого мозга протекало под влиянием иных антагонистических и неантагонистических процессов – в частности, здесь имел место половой отбор (Марков, 2008), в конечном итоге имеющий отношение к противоречию последовательности гена и его функции (Kokko & Jennions, 2014). Более того, часто эволюционные инновации имеют неантагонистические механизмы происхождения, такого, например, случайное блуждание в пространстве генотипов (Wagner, 2011) и конструктивная нейтральная эволюция (Stoltzfus, 2012). Тем не менее, такие масштабные революции в жизни, как происхождение клеток и эукариот, имеют во многом диалектический сценарий происхождения.

Дальнейшие исследования в молекулярной и эволюционной биологии, подкрепленные диалектической философской методологией, позволят более точно ответить на вопрос, насколько эволюция диалектична. Более того, необходим количественный подход к диалектическому анализу эволюционных процессов – в частности, количественная оценка противоположных эффектов, на основе данных о частоте встраивания транспозонов, эффективности геномных систем защиты и т. д. Это позволит предсказывать исход тех или иных диалектических эволюционных процессов, например, эволюцию раковой опухоли. Наконец, диалектический анализ эволюции жизни позволит лучше понять диалектическое же развитие современного капиталистического общества (с учетом того что всякая аналогия ложна), более точно и количественно оценить противоборствующие силы, и, основываясь на этом, преобразовать общество.

Список литературы

Гегель, Г. В. Ф. Наука логики. В 3-х томах. «Мысль» 501 (1970). Available at: http://hegel.rhga.ru/filosof/logik/detail.php?ELEMENT_ID=102&ART_NAME=Наука логики том 1. (Accessed: 6th March 2020)

Е. Кунин. Логика случая. О природе и присхождении биологической эволюции. Центрполиграф (2018). Available at: https://www.labirint.ru/books/425086/?point=gg51&gclid=Cj0KCQiAhojzBRC3ARIsAGtNtHW0cNmNaTe4ddkHPHDlMA4OqpWzzIxgmLlOCUTyFyvuhGuSEhAKjxoaAg8KEALw_wcB. (Accessed: 6th March 2020)

Ильенков. К вопросу о противоречии в мышлении. «Вопросы философии» 63–72 (1957). Available at: http://caute.ru/ilyenkov/texts/vf/quecontr.html. (Accessed: 6th March 2020)

Карл Маркс. Капитал. Т. 1. Портал ‘Коммунизм’ (1867). Available at: https://www.esperanto.mv.ru/Marksismo/Kapital1/. (Accessed: 6th March 2020)

Комолов О.О. ТЕНДЕНЦИИ МОНОПОЛИЗАЦИИ СОВРЕМЕННОЙ РЫНОЧНОЙ ЭКОНОМИКИ (ПОЛИТИКО-ЭКОНОМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ). (2016).

Ленин В. И. Государство и революция. «Жизнь и знание» (1917). Available at: https://ru.wikisource.org/wiki/Государство_и_революция_(Ленин). (Accessed: 6th March 2020)

М. Никитин. Происхождение жизни. От туманности до клетки – скачать fb2, epub, pdf на ЛитРес. Альпина Диджитал 1–590 (2016). Available at: https://www.litres.ru/mihail-nikitin-9854771/proishozhdenie-zhizni-ot-tumannosti-do-kletki/?utm_medium=cpc&utm_source=google&utm_campaign=DSA%7C149839530&utm_term=&utm_content=k50id%7Caud-439585589972%3Adsa-179513627318%7Ccid%7C149839530%7Caid%7C362195403. (Accessed: 8th March 2020)

Марков Александр. ПРОИСХОЖДЕНИЕ ЧЕЛОВЕКА И ПОЛОВОЙ ОТБОР. Историческая психология и социология истории 4, (2008).

Ф. Энгельс. Диалектика природы. Партиздат (1934). Available at: http://filosof.historic.ru/books/item/f00/s01/z0001011/st000.shtml. (Accessed: 6th March 2020)

Aguado, L. C. et al. Homologous recombination is an intrinsic defense against antiviral RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E9211–E9219 (2018).

Barry, J. D. & McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv. Parasitol. 49, 1–70 (2001).

Bliven, K. A. & Maurelli, A. T. Evolution of Bacterial Pathogens Within the Human Host. Microbiol. Spectr. 4, (2016).

Boehm, T. & Swann, J. B. Origin and evolution of adaptive immunity. Annu. Rev. Anim. Biosci. 2, 259–83 (2014).

Brennan, J. J. & Gilmore, T. D. Evolutionary Origins of Toll-like Receptor Signaling. Mol. Biol. Evol. 35, 1576–1587 (2018).

Bryson, A. L. et al. Covalent Modification of Bacteriophage T4 DNA Inhibits CRISPR-Cas9. MBio 6, e00648 (2015).

Cerutti, H. & Casas-Mollano, J. A. On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man. Curr. Genet. 50, 81–99 (2006).

David Harvey. Marx, Capital, and the Madness of Economic Reason. Oxford University Press (2017). Available at: https://books.google.ru/books?hl=ru&lr=&id=-KE5DwAAQBAJ&oi=fnd&pg=PP1&dq=David+Harvey+marxism&ots=SyUp2Rn229&sig=f1Nin94pkA5FKu-NO848PSqcRXs&redir_esc=y#v=onepage&q=David Harvey marxism&f=false. (Accessed: 6th March 2020)

Dawkins, R. The extended phenotype : the long reach of the gene. (Oxford University Press, 1989).

Dawkins, R. The selfish gene. (Oxford University Press, 1989).

Denner, J. Expression and function of endogenous retroviruses in the placenta. APMIS 124, 31–43 (2016).

Ecco, G., Imbeault, M. & Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development 144, 2719–2729 (2017).

Eigen, M. Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules. Naturwissenschaften 58, 465–523 (1971).

Guan, S. G. & Qi, A. S. Contributions of memory B cells to secondary immune response. Bull. Math. Biol. 57, 713–31 (1995).

Ha, M. & Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 509–24 (2014).

Hall, A. M., Gollan, B. & Helaine, S. Toxin-antitoxin systems: reversible toxicity. Curr. Opin. Microbiol. 36, 102–110 (2017).

Herwald, H. & Egesten, A. Cells of Innate and Adaptive Immunity: A Matter of Class? J. Innate Immun. 9, 109–110 (2017).

Hickman, A. B. & Dyda, F. Mechanisms of DNA Transposition. Microbiol. Spectr. 3, MDNA3-0034–2014 (2015).

Hille, F. et al. The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward. Cell 172, 1239–1259 (2018).

Hirano, M., Das, S., Guo, P. & Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity in vertebrates. Adv. Immunol. 109, 125–57 (2011).

Huang, L. H., Farnet, C. M., Ehrlich, K. C. & Ehrlich, M. Digestion of highly modified bacteriophage DNA by restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 10, 1579–91 (1982).

Hurst, T. P. & Magiorkinis, G. Epigenetic Control of Human Endogenous Retrovirus Expression: Focus on Regulation of Long-Terminal Repeats (LTRs). Viruses 9, (2017).

Kokko, H. & Jennions, M. D. The relationship between sexual selection and sexual conflict. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, a017517 (2014).

Komolov OO. THE PROBLEM OF MONOPOLIZATION OF PRODUCTION IN MARXIST PARADIGM AND MODERN WORLD. TERRA Econ. (2015).

Koonin, E. V. The origin of introns and their role in eukaryogenesis: a compromise solution to the introns-early versus introns-late debate? Biol. Direct 1, 22 (2006).

Koonin, E. V. Temporal order of evolution of DNA replication systems inferred by comparison of cellular and viral DNA polymerases. Biol. Direct 1, 39 (2006).

Koonin, E. V. On the origin of cells and viruses: primordial virus world scenario. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1178, 47–64 (2009).

Koonin, E. V. Viruses and mobile elements as drivers of evolutionary transitions. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 371, (2016).

Koonin, E. V & Dolja, V. V. A virocentric perspective on the evolution of life. Curr. Opin. Virol. 3, 546–557 (2013).

Koonin, E. V, Makarova, K. S. & Wolf, Y. I. Evolutionary Genomics of Defense Systems in Archaea and Bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 71, 233–261 (2017).

Koonin, E. V, Senkevich, T. G. & Dolja, V. V. The ancient Virus World and evolution of cells. Biol. Direct 1, 29 (2006).

Koonin, E. V., Makarova, K. S., Wolf, Y. I. & Krupovic, M. Evolutionary entanglement of mobile genetic elements and host defence systems: guns for hire. Nat. Rev. Genet. 21, 119–131 (2020).

Krupovic, M., Dolja, V. V & Koonin, E. V. Origin of viruses: primordial replicators recruiting capsids from hosts. Nat. Rev. Microbiol. 17, 449–458 (2019).

Lang, A. S., Westbye, A. B. & Beatty, J. T. The Distribution, Evolution, and Roles of Gene Transfer Agents in Prokaryotic Genetic Exchange. Annu. Rev. Virol. 4, 87–104 (2017).

Lequeux, J. Birth, evolution and death of stars. (World Scientific, 2013).

Li, F. & Wang, A. RNA decay is an antiviral defense in plants that is counteracted by viral RNA silencing suppressors. PLoS Pathog. 14, e1007228 (2018).

Mello, C. C. & Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature 431, 338–42 (2004).

MF, F. A Cold-Blooded View of Adaptive Immunity. Nat. Rev. Immunol. 18, (2018).

Motofei, I. G. Biology of Cancer; From Cellular Cancerogenesis to Supracellular Evolution of Malignant Phenotype. Cancer Invest. 36, 309–317 (2018).

Mulkidjanian, A. Y. On the origin of life in the zinc world: 1. Photosynthesizing, porous edifices built of hydrothermally precipitated zinc sulfide as cradles of life on Earth. Biol. Direct 4, 26 (2009).

Niether, D., Afanasenkau, D., Dhont, J. K. G. & Wiegand, S. Accumulation of formamide in hydrothermal pores to form prebiotic nucleobases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 4272–7 (2016).

Pawluk, A., Davidson, A. R. & Maxwell, K. L. Anti-CRISPR: discovery, mechanism and function. Nat. Rev. Microbiol. 16, 12–17 (2018).

Pleška, M. & Guet, C. C. Effects of mutations in phage restriction sites during escape from restriction-modification. Biol. Lett. 13, (2017).

Reisenauer, A., Kahng, L. S., McCollum, S. & Shapiro, L. Bacterial DNA methylation: a cell cycle regulator? J. Bacteriol. 181, 5135–9 (1999).

Rogozin, I. B., Carmel, L., Csuros, M. & Koonin, E. V. Origin and evolution of spliceosomal introns. Biol. Direct 7, 11 (2012).

S, G. Why Be Temperate: Lessons From Bacteriophage λ. Trends Microbiol. 24, (2016).

Sarkar, A., Volff, J.-N. & Vaury, C. piRNAs and their diverse roles: a transposable element-driven tactic for gene regulation? FASEB J. 31, 436–446 (2017).

Stanley, S. Y. & Maxwell, K. L. Phage-Encoded Anti-CRISPR Defenses. Annu. Rev. Genet. 52, 445–464 (2018).

Sternberg, S. H., Richter, H., Charpentier, E. & Qimron, U. Adaptation in CRISPR-Cas Systems. Mol. Cell 61, 797–808 (2016).

Stoltzfus, A. Constructive neutral evolution: exploring evolutionary theory’s curious disconnect. Biol. Direct 7, 35 (2012).

Sultana, T., Zamborlini, A., Cristofari, G. & Lesage, P. Integration site selection by retroviruses and transposable elements in eukaryotes. Nat. Rev. Genet. 18, 292–308 (2017).

Swart, E. C. & Nowacki, M. The eukaryotic way to defend and edit genomes by sRNA-targeted DNA deletion. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1341, 106–14 (2015).

Takeda, K. & Akira, S. Toll-like receptors. Curr. Protoc. Immunol. 109, 14.12.1-14.12.10 (2015).

Takeuchi, N., Hogeweg, P. & Koonin, E. V. On the origin of DNA genomes: evolution of the division of labor between template and catalyst in model replicator systems. PLoS Comput. Biol. 7, e1002024 (2011).

Villarreal, L. P. Viruses and the placenta: the essential virus first view. APMIS 124, 20–30 (2016).

Wagner, A. The molecular origins of evolutionary innovations. Trends Genet. 27, 397–410 (2011).

Wilson, G. G. Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res. 19, 2539–66 (1991).