Курсовая работа на тему: Определение хлорамфеникола в молоке методом иммунохроматографического анализа.
У нас на сайте представлено огромное количество информации, которая сможет помочь Вам в написании необходимой учебной работы.
Но если вдруг:
Вам нужна качественная учебная работа (контрольная, реферат, курсовая, дипломная, отчет по практике, перевод, эссе, РГР, ВКР, диссертация, шпоры...) с проверкой на плагиат (с высоким % оригинальности) выполненная в самые короткие сроки, с гарантией и бесплатными доработками до самой сдачи/защиты - ОБРАЩАЙТЕСЬ!
Курсовая работа на тему: Определение хлорамфеникола в молоке методом иммунохроматографического анализа.
Оглавление
2.1 Иммунохроматографический анализ
2.1.2 Основные компоненты тест-систем
2.1.3 Метки в иммунохроматографическом анализе
2.3 Существующие методы определения хлорамфеникола.
3.1 Химические реагенты и биологические препараты
3.4.1 Получение конъюгатов сукцината ХАФ с БСА (ХАФ-БСА)
3.4.2 Получение наночастиц золота
3.4.3 Получение конъюгата наночастиц золота с антителами
3.4.4 Изготовление иммунохроматографической тест-полоски
3.4.5 Проведение иммунохроматографического анализа
3.5 Определение аналитических характеристик
4.2 Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения ХАФ
4.3 Определение хлорамфеникола в молоке.
1 Введение
В настоящее время так называемые «быстрые методы» проведения анализа различных соединений c визуальной регистрацией результатов нашли широкое применение в самых различных областях: медицинской диагностике, фармацевтической и пищевой промышленности, ветеринарии, охране окружающей среды и т.д. Использование этих методов обусловлено коротким временем анализа (5-20 мин), простой и доступной процедурой определения, не требующей дорогостоящего оборудования, возможностью проведения анализа во внелабораторных условиях, высокой чувствительностью, низкой стоимостью и др. Наиболее распространенным вариантом являются методы латерального проточного иммуноанализа или иммунохроматографического анализа (ИХА), которые основаны на использовании мембранных носителей с заранее нанесенными на них реакционными компонентами, позволяющими выявлять наличие определяемого соединения по окрашиванию тестовой зоны мембраны [[1], [2]]. Этот вид анализа позволяет в течение нескольких минут определить и оценить содержание различных биологически активных соединений, в частности, антибиотиков в пищевых продуктах.
Антибиотики широко используются в ветеринарии для лечения и профилактики ряда заболеваний животных, птиц, пчел, рыбы, ракообразных и др. Одним из таких антибиотиков является хлорамфеникол (ХАФ) или левомицетин – антибиотик широкого спектра действия, характеризующимся хорошими антибактериальными и фармакокинетическими свойствами [[3]]. Но наличие остаточных количеств антибиотиков в молоке, мясе и других продуктах может негативно сказываться на здоровье человека. Так, ХАФ является гемотоксичным веществом, способным вызывать аплазию костного мозга и, как следствие, апластическую анемию. В связи с этим в ряде стран (Россия, страны ЕС, США, Канада и др.) использование ХАФ было запрещено и установлен минимально допустимый уровень остаточного количества антибиотика в продуктах питания. Однако вследствие высокой эффективности ХАФ и низкой стоимости его до сих пор (часто незаконно) иногда применяют в ветеринарной практике. Определение остаточного количества данного антибиотика в пищевых продуктах является важной аналитической задачей. Для проведения таких анализов необходимы простые и быстрые, но высокочувствительные и надежные диагностические методы.
Целью настоящей работы является создание высокочувствительной иммунохроматографической тест-системы для количественного определения концентрации хлорамфеникола в молоке. Решению этой задачи посвящена данная курсовая работа.
2 Обзор литературы
2.1 Иммунохроматографический анализ
2.1.1 Общие принципы ИХА
Иммунохроматографический метод анализа (ИХА) основан на принципах тонкослойной хроматографии и включает в себя реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом с образованием специфических иммунокомплексов, которые можно регистрировать визуально при помощи меток [2]. В качестве меток используют окрашенные латексы, квантовые точки, магнитные частицы и другие. Но наиболее широкое распространение в методах ИХА получили наночастицы золота (НЧЗ) благодаря легкости получения частиц заданного размера и высокой чувствительности визуальной детекции [[4]].
ИХА проводится при помощи специальных мембранных полосок, которые включают в себя все необходимые реагенты, т.е. для проведения анализа достаточно лишь добавить анализируемый образец. Тест-полоска состоит из четырех частей (рис. 1), размещенных на опорной пластинке (как правило, пластиковой) [1].
1. Мембрана для нанесения образца – специальная мембрана, с которой начинается движение образца вдоль полоски под действием капиллярных сил.
2. Мембрана для конъюгата – здесь нанесен конъюгат специфических антител/антигенов с красящей меткой.
3. Аналитическая мембрана – мембрана, в тестовой зоне которой в виде линий прочно иммобилизованы специфические антитела или антигены, а в контрольной зоне расположены вторичные антитела, которые являются индикатором правильности проведения анализа.
4. Впитывающая мембрана – обеспечивает равномерное движение образца вдоль полоски.
Рис. 1. Типичный вид тест-полоски для ИХА
Важным моментом является расположение мембран друг относительно друга – они должны располагаться таким образом, чтобы край предыдущей мембраны был немного сверху начала следующей. Это обеспечивает равномерный перенос компонентов образца между частями тест-полоски.
Различают две основные схемы иммунохроматографического анализа: прямая и конкурентная.
1. Прямая или сэндвич схема ИХА (рис. 2) используется для обнаружения высокомолекулярных соединений, таких как вирусы, белковые гормоны, возбудители инфекционных заболеваний.
Рис. 2. Схема прямого ИХА [[5]]
В данной схеме используется конъюгат специфических антител с красящей меткой (в случае визуальной оценки результата), нанесенный на мембрану для конъюгата. В тестовой зоне иммобилизованы антитела, специфические к аналиту, а в контрольной – антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, по мере продвижения вдоль полоски на мембране с конъюгатом происходит связывание аналита с мечеными антителами. Затем образовавшийся иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где связывается с иммобилизованными специфическими антителами, образуя «сэндвич». Это проявляется в виде образования окрашенной линии, интенсивность окраски которой пропорциональна концентрации аналита в образце. Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.
2. Для обнаружения низкомолекулярных соединений в ИХА используются методы конкурентного анализа или непрямая схема (рис. 3).
Рис. 3. Схема конкурентного ИХА [5]
В данном методе анализа свободный аналит в растворе образца конкурирует с нанесенным в тестовой зоне аналитом за связывание со специфическими антителами, мечеными коллоидными частицами золота. Интенсивность окраски тестовой зоны будет обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в образце. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста, а наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа [[6]].
2.1.2 Основные компоненты тест-систем
Аналитическая мембрана.
Аналитическая мембрана тонкая и хрупкая, поэтому она крепится на пластиковый или нейлоновый опорный слой, чтобы ее можно было резать и брать руками. Чаще всего ее делают из нитроцеллюлозы, хотя используют и другие доступные материалы, например нейлон, полиэфирсульфон, полиэтилен.
Размер пор мембран на основе нитроцеллюлозы составляет от 0,05 до 15 мкм. Однако не только размер пор мембраны и материал, из которого она сделана, но и скорость переноса анализируемого образца вдоль полоски играет роль, поскольку она влияет на оптимальное время анализа [2].
На аналитической мембране располагаются иммобилизованные компоненты – специфические иммунореагенты. Обычно их наносят на специальном приборе в виде узких линий, находящихся недалеко друг от друга. Материал мембраны влияет на ее сорбционные свойства. Нитроцеллюлозные мембраны связываются с белками за счет диполь-дипольных взаимодействий между нитроэфирными группами мембраны и карбнонильными группами пептидных связей белков. В случае полиэфирсульфоновых мембран связывание происходит за счет гидрофобного эффекта, а в случае нейлона действуют ионные и электростатические силы [2].
Поверхностно-активные вещества.
Поскольку большинство мембран для тестов имеет гидрофобную нитроцеллюлозную основу, для улучшения смачиваемости мембраны вводят поверхностно-активные вещества (ПАВ) [5,[7]].
Введение ПАВ может оказывать влияние на следующие процессы:
· Капиллярная скорость протекания раствора вдоль мембраны.
Чтобы придать смачиваемость мембране, в ее поры вводят определенное количество ПАВ. Чаще всего это количество обеспечивает максимальную скорость потока жидкости вдоль мембраны.
· Адсорбция белков.
Введение различного рода ПАВ может оказать сильное влияние на сорбционные свойства мембраны. Избыток вводимых веществ может приводить к уменьшению количества белка, которое способна сорбировать на себе мембрана.
· Эффективность прохождения реагентов вдоль мембраны.
Эффективность прохождения реагентов вдоль мембраны напрямую обусловлена смачиваемостью мембраны. Количество ПАВ следует выбирать так, чтобы оптимизировать параметры сорбции реагентов по мембране и ширину окрашенной полосы, которая будет сохраняться на протяжении всего анализа.
· Ширина полосы.
Увеличение количества ПАВ на мембране может приводить к уширению тестовой линии, что в свою очередь может приводить к снижению интенсивности наблюдаемого сигнала и потери чувствительности анализа.
При введении ПАВ в реакционный раствор следует помнить, что также возможно вымывание уже присутствующих добавок в мембране, что приведет к изменению смачиваемости и других характеристик.
Мембрана для нанесения образца.
Основными задачами мембраны для нанесения образца являются обеспечение продвижения и равномерное распределение образца на мембране с конъюгатом и аналитической мембране. Мембрана может быть пропитана белками, детергентами, усилителями вязкости и буферными солями, что позволяет влиять на скорость потока образца. Цель этих добавок может состоять в увеличении вязкости образца, увеличении времени реакции на мембране с конъюгатом или даже химической модификации образца для связывания на тестовой линии.
Материал мембраны часто выбирается заранее в соответствии с целью испытания и свойствами образца. На данный момент существует два различных типа мембран для нанесения образца: тканая и целлюлозная [5, 7].
Тканая сетка используется для равномерного распределения образца по мембране с конъюгатом. Эти мембраны достаточно дороги, обладают большой механической прочностью, но малым удерживаемым объемом жидкости по сравнению с целлюлозными мембранами, что делает невозможным введение в них различного рода добавок.
Целлюлозные мембраны значительно дешевле, обладают малой механической прочностью, но большим объемом удерживаемой жидкости, однако их можно дополнительно обработать, что позволяет, например, уменьшить неспецифическое связывание, контролировать условия среды протекания реакции. Именно этот тип мембран для нанесения образца чаще всего используется для быстрого анализа.
Мембрана для нанесения конъюгата.
Целью этой мембраны является равномерный перенос образца и конъюгата к аналитической мембране.
В идеале мембрана должна обладать следующими свойствами [7]:
· низким неспецифическим связыванием, чтобы весь аналит из образца перешел на аналитическую мембрану;
· равномерной скоростью течения жидкости для обеспечения равномерного анализа;
· постоянным и равномерным распределением свободного объема по мембране, т.к. количество переносимого конъюгата, находящегося на мембране после его нанесения, должно быть одинаковым для различных образцов;
· низкой экстрагируемостью из мембраны по отношению к химическим примесям в мембране и механическим включениям;
· хорошей операционной стабильностью.
Материалом для мембраны послужили нетканые тонкослойные фильтры, характеризующиеся величиной волокон, толщиной, удельным весом, экстрагируемостью и скоростью прохождения воздушного потока.
Впитывающая (абсорбирующая) мембрана.
Основной функцией этой мембраны является увеличение объема жидкости, проходящей через аналитическую мембрану, что приводит к увеличению чувствительности метода. Материалом для мембраны чаще всего служат целлюлозные фильтры [7].
2.1.3 Метки в иммунохроматографическом анализе
Метка играет огромную роль в быстрых иммунохроматографических анализах, поскольку с ее помощью можно оценить результат визуально, не прибегая к дополнительным процедурам или использованию специального оборудования.
Идеальная метка для анализа должна [5]:
· регистрироваться несколькими методами или технологиями в очень большом диапазоне;
· просто и эффективно связываться с биологическими веществами в конъюгаты без потери химической и биологической активности;
· обладать низким или вообще не обладать неспецифическим взаимодействием, то есть отношение сигнал/шум в многокомпонентных системах должно быть наибольшим;
· быть устойчивой в данных химических условиях анализа и при данной температуре;
· быть коммерчески доступной, иметь низкую стоимость;
· легко переносится потоком жидкости;
· быть способной к использованию для обнаружения нескольких аналитов.
Тем не менее, идеальной метки, которая удовлетворяла бы всем вышеперечисленным условиям, не существует. На данный момент наиболее распространенными метками являются следующие варианты.
Липосомы.
Липосомы представляют собой везикулы (пузырьки), сформированные из липидного бислоя. Ввиду их способности инкапсулировать высокие концентрации сигнальных молекул в своих ядрах [[8]], чувствительность теста может быть увеличена на 2-3 порядка.
В зависимости от используемого метода и требуемой чувствительности теста, размер липосом может колебаться от 50 до 800 нм. Кроме того, на липидную поверхность могут быть нанесены разные химически активные вещества, например, антитела или ферменты [[9]].
Основным недостатком липосом является относительная нестабильность и возможность лизиса из-за присутствия поверхностно-активных веществ. Другой проблемой является недостаток знаний в области высушивания и последующего восстановления липосом, что затрудняет коммерциализацию метода.
Коллоидный углерод.
Первое сообщение об использовании коллоидных частиц углерода появилось в 1993 году [[10]].
Преимуществами использования коллоидного углерода в качестве метки являются хорошая стабильность, дешевизна и доступность, а серо-черный цвет метки позволяет легко обрабатывать результаты для количественной оценки [[11]]. Также с коллоидным углеродом довольно легко можно получать конюъгаты с биомолекулами, однако, в отличие от коллоидного золота для этого требуется несколько больше времени – от одного до нескольких часов.
Несмотря на то, что коллоидные наночастицы золота наиболее часто используются в качестве метки, в некоторых работах углеродные наночастицы позволяют достичь меньших пределов обнаружения [[12]].
Флуоресцентные метки.
В качестве флуоресцентных меток чаще всего используют ксантеновые красители (флуоресцеин, техасский красный) и длинноволновые циановые красители (Су). Другой класс флуоресцентных меток – комплексы лантанидов [[13]]. Они уступают в яркости другим флуоресцентным меткам, но имеют очень большой Стоксов сдвиг. Время жизни у них также больше, чем у других меток, что позволяет разрабатывать чувствительные анализы с временным разрешением. Типичными представителями комплексов лантанидов являются комплексы европия, тербия и рутения, как, например, в работе [[14]].
Квантовые точки.
Квантовые точки это еще один класс флуоресцентных меток, которые представляют собой нанокристаллы или полупроводниковые нанокристаллы, обычно состоящие из CdSe, CdS, ZnSe, InP, InAs или слоя AnS (CdS) на ядре CdSe.
Когда полупроводник поглощает фотон, имеющий энергию большую, чем ширина запрещенной зоны, электрон перемещается с валентной зоны в проводящую, оставляя положительно заряженную дырку. Пара электрон–дырка называется экситоном. Экситон напоминает искусственный атом, имеющий радиус 1-10 нм, который зависит от свойств полупроводника. С уменьшением размера кристалла экситон все больше напоминает частицу в коробке. Его энергетические уровни в значительной степени определяются размером частицы (коробки) нежели свойствами полупроводника [[15]]. Полупроводниковые нанокристаллы, которые проявляют сильное квантовое удержание во всех трех измерениях, называют квантовыми точками. В результате рекомбинации электрона и дырки наблюдается свечение, длина волны которого зависит от размера частицы и разницы энергий проводящей и валентной зоны – чем больше разность энергий, тем больше смещение в сторону голубого цвета, чем меньше, тем больше смещение в сторону красного цвета [[16]]. Можно сделать квантовые точки одинакового размера, которые будут иметь узкие полосы испускания излучения, шириной в районе 10-50 нм.
Желательно, чтобы квантовые точки обладали следующими характеристиками [5]:
· сильной флуоресценцией с квантовым выходом больше 0,5;
· устойчивостью к фотообесцвечиванию;
· возможностью получения коллоидных суспензий с узким спектром излучения;
· возможность варьирования размера наночастиц в процессе производства для получения флуоресценции различных цветов;
· коммерческой доступностью.
В работе [[17]] разработали иммунохроматографический тест для одновременного определения в молоке трёх антибиотиков стрептомицина, хлорамфеникола и офлоксацина в формате так называемого «светофора». В качестве меток использовали квантовые точки с разными пиками эмиссии (525, 585 и 625 нм), что позволило в тестовой зоне наблюдать окрашенные полосы зелёного, жёлтого и красного цвета, соответственно.
Биолюминесцентные маркеры.
Перспективной люминесцентной меткой является рекомбинантный белок экворин. Белок был впервые выделен из медузы Aequorea Victoria. При активации ионами кальция экворин испускает свет в результате межмолекулярной реакции, в которой коэлентеразин (имидапиразиновое соединение не ковалентно связанное с белком) окисляется до коэлентарамида, испуская тем самым голубой свет с максимальной длиной волны 470 нм и образуя диоксид углерода. Количество выделяемого света пропорционально количеству активированного фотопротеина [[18]].
По мере прохождения анализируемой жидкости по полоске вначале аналит связывается с антителами, меченными экворином. После этого не вступивший в реакцию конъюгат антитело-экворин связывается с иммобилизованным в зоне «захвата» аналитом, а образовавшийся ранее иммунохимический комплекс проходит далее, попадая в третью зону, где иммобилизованы ионы кальция. В этой зоне происходит активация экворина, а излучаемый свет регистрируется фотоприемником [[19]].
Парамагнитные частицы.
Парамагнитные частицы это наночастицы оксида железа, которые становятся магнитными только при внесении их в магнитное поле. Эти коллоидные частицы могут быть покрыты полимерным покрытием, на котором могут адсорбироваться или связываться с ним ковалентно антитела и антигены. Такие конъюгаты применяют также как в случае использования коллоидного золота в качестве метки. Регистрируемым сигналом является магнитный поток, измеряемый при помещении парамагнитных частиц в магнитное поле.
Среди преимуществ использования данных частиц в качестве меток выделяют следующие: низкий уровень шума ввиду отсутствия магнетизма у аналита и биологического материала, стабильный и не исчезающий во времени сигнал, который можно измерить повторно при необходимости [[20], [21]], а также возможность модифицировать поверхность наночастицы [[22]].
Латексные частицы.
Латексные частицы первыми использовались в иммуноанализе в качестве метки. Они широкодоступны и относительно дешевы. Основным материалом для них служит стирол или его производные. Обычно латексные частицы содержат функциональные группы, способные ковалентно связывать антитела или антигены. Кроме того в них можно встраивать флуоресцентные красители, получая окрашенные латексы, которые нашли коммерческое применение [[23]]. Отсюда вытекает существенное преимущество латексных частиц – их можно детектировать несколькими способами сразу, например, парамагнитные частицы способны флуоресцировать и они при этом являются окрашенными
Коллоидное золото.
Возможно, что сегодня коллоидное золото наиболее часто используется в качестве метки в иммунохроматографическом анализе. На это есть несколько причин. Во-первых, оно является недорогим, во-вторых, легко и быстро готовится в лаборатории, в-третьих, коллоидное золото имеет интенсивную окраску и не требует дополнительных процессов для его визуализации [[24]]. Помимо этого существует огромное количество литературы, посвященной использованию коллоидного золота в качестве метки. Сама метка является стабильной в жидкости и в сухом виде. В дополнение к перечисленному, коллоидное золото как в форме метки, так и в форме конъюгатов с иммунореагентами коммерчески доступно. В ИХА, как правило, используются НЧЗ с диаметром 15-40 нм.
Коллоидную частицу золота можно представить условно в виде мицеллы [[25]]:
{[Au]m| n(AuCl4-)(n – x)H+| xH+|}x-,
Мицелла золота состоит из кристаллического ядра [Au]m, на поверхности которого адсорбированы ионы AuCl4-, которые определяют отрицательный заряд частицы. Кроме этого ионы AuCl4- составляют внутренний слой двойного электрического слоя и определяют величину потенциала адсорбции. Ионы Н+ находятся в интермицеллярном растворе. Наночастицы золота обладают уникальными оптическими свойствами, в частности явлением поверхностно плазмонного резонанса на длине волны 520 нм, который сдвигается в длинноволновую область с увеличением размера частиц.
В зависимости от условий получения, размеры синтезируемых наночастиц золота (НЧЗ) могут сильно отличаться друг от друга. Условно методы получения коллоидного золота можно разделить на дисперсионные (измельчение металла) и конденсационные (восстановление солей металла). Поскольку второй способ более распространен, остановимся на нем подробнее.
В основе методов синтеза НЧЗ лежит реакция химического восстановления соли золота Au3+ c образованием пересыщенного раствора молекулярного золота и последующего образования наночастиц золота. В качестве восстановителей применяют различные органические и неорганические вещества. В ранних работах по получению коллоидного золота в качестве восстановителя использовали этиловый спирт, белый фосфор и формальдегид. В настоящее время, используя эти восстановители, можно получать НЧЗ со средним диаметром 5-12 нм. Использование в качестве восстановителя боргидрида натрия позволяет получать частицы со средним диаметром 5 нм, тиоцианата натрия – 2-3 нм, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) – около 20 нм [[26]]. Однако полученные этими методами золи золота обладают ограниченной стабильностью, а размер частиц сильно зависит от условий проведения реакции.
Стабильные монодисперсные наночастицы золота с диаметром 15-50 нм позволяет получить метод Френса [[27]], который является быстрым и простым в исполнении. В качестве восстановителя золотохлористоводородной кислоты используют цитрат натрия, реакция проводится при 100˚С.
2.2 Хлорамфеникол.
Рис. 4. Структура ХАФ
Хлорамфеникол (ХАФ) или левомицетин является антибиотиком широкого спектра действия. Название по ИЮПАК: D-(-) – трео-1-(n-нитрофенил)-2дихлор-ацетиламино-1,3-пропандиол (рис. 4). Он активен к грамположительным и грамотрицательным бактериям, а также к штаммам, устойчивым к пенициллину, стрептомицину, сульфаниламидам. Устойчивость микроорганизмов к хлорамфениколу вырабатывается медленно [3]. ХАФ был одним из первых антибиотиков, которые стали получать синтетически в промышленных масштабах.
ХАФ используют для лечения таких заболеваний, как менингит, холера, чума, брюшной тиф, конъюнктивит . В настоящее время он сравнительно мало используется в медицине, поскольку имеет множество побочных эффектов, таких как апластическая анемия, лейкемия, угнетение головного мозга. Также у людей, принимающих данный антибиотик, были описаны головная боль, легкая депрессия, спутанность сознания и делирий. Ввиду этого ХАФ используется только в случаях, когда нет альтернативы.
В настоящее время хлорамфеникол иногда используется в животноводстве для лечения ряда заболеваний или в качестве профилактического средства. Однако ввиду того, что ХАФ легко растворяется в жирах и всасывается в кровь, через продукты животного происхождения, например, молоко, яйца, мёд и другие этот антибиотик может попадать в организм человека и накапливаться в нем. На человека это может оказывать токсический эффект, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов и других неблагоприятных явлений. В связи с этим ряд стран, в том числе страны Европейского союза и Россия, не допускают или строго ограничивают наличие хлорамфеникола в продуктах питания, а для методов его определения был установлен критерий «Minimum Required Performance Limit» (MRPL), согласно которому минимальная определяемая с помощью данной методики концентрация должна быть не больше 0,3 нг/мл (0,3 мкг/кг) [[28],[29]].
2.3 Существующие методы определения хлорамфеникола.
На сегодняшний день существует множество методов определения хлорамфеникола в пищевых продуктах как физико-химических, так и иммунохимических.
Хроматографические методы для определения ХАФ применяют уже сравнительно давно. Предложено большое число вариантов таких методов с применением различных видов хроматографии, условий ее проведения и способов детектирования. Одним из часто встречающихся методов является газовая хроматография в сочетании с электронно-захватным детектором [[30]] или с масс-спектрометром [[31]].
Еще один широко применяемый метод – высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [[32]]. Она позволяет измерять концентрацию ХАФ в молоке с разной степенью точности. Например, если в качестве предварительной обработки использовать твердофазную экстракцию, то предел обнаружения составляет 10 нг/мл [[33]], а при использовании жидкостно-жидкостной экстракции предел обнаружения можно понизить до 0,3 нг/мл, а предел определения в этом случае составит 1 нг/мл [[34]]. В последнее время предел обнаружения методом ВЭЖХ пытаются снизить, изменяя условия экстракции, делая ее более селективной и эффективной, например, используя магнитную твердофазную экстракциию [[35]]. Довольно часто метод ВЭЖХ применяется в тандеме с масс-спектрометрией. Пределы обнаружения и определения составляют 0,05 нг/мл и 0,2 нг/мл, соответственно [[36]].
Хроматографические методы незаменимы для окончательного подтверждения наличия антибиотика в образце, однако не подходят для массовых анализов, поскольку для их проведения требуется трудоёмкая предварительная обработка анализируемого объекта (экстракция), высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование, что является серьезными недостатками.
Для скрининговых целей во всем мире используются, в основном, методы иммунохимического анализа, основанные на реакции антиген-антитело. По сравнению с инструментальными физико-химическими методами они более дешевые, относительно простые и быстрые. Очень специфичным и чувствительным является метод иммуноферментного анализа (ИФА), в котором в качестве метки используются ферменты, чаще всего пероксидаза хрена. Предел обнаружения для ИФА может составлять 0,042 – 0,1 нг/мл при определении ХАФ в молоке [[37], [38]]. Но обычно методы ИФА позволяют определять остатки ХАФ в нескольких видах продуктов сразу, например в мясе, яйцах, меде и молоке, пределы обнаружения в этом случае несколько возрастают и составляют примерно 0,22 – 0,3 нг/мл, что соответствует критерию MRPL [[39], [40]]. Использование хемилюминесцентноой детекции в иммуноферментноом анализе позволяют снизить предел определения в 10 раз до 0,006 нг/мл [[41]].
Определение веществ методом иммунохроматографического анализа не занимает всего 10-15 минут. Результаты анализа можно наблюдать невооруженным глазом, а для количественной оценки можно использовать специальное оборудование. Достоинствами метода являются его простота и наглядность. Предел обнаружения составляет 5-10 нг/мл для человеческого глаза и 0,5 нг/мл для инструментального определения [17,[42]]. Однако оптимизацией условий анализа, например, изменяя размер наночастиц золота и количество добавляемых антител, можно достичь предела обнаружения 2,4 нг/мл при визуальной регистрации результатов, а с использованием оборудования – 0,016 нг/мл [[43]]. Интересными и перспективными вариантами ИХА являются тесты, способные определять сразу несколько антибиотиков в одном образце, что позволяет сократить время исследования и снизить расход реагентов [17,[44]].
Существуют также методы анализа, использующие явление флуоресценции, они являются достаточно быстрыми (занимают около 20 минут), описанные пределы обнаружения равны 0,2 нг/мл, пределы определения – 0,3 нг/мл [[45]]. В качестве меток в таких анализах используют различные соединения, например квантовые точки на основе CdSe/ZnS, передел обнаружения в этом случае составляет 10 пг/мл [[46]] или металлоорганический биосенсор на основе цирконий порфиринового каркаса (0,08 пг/мл) [[47]]. Однако методы, основанные на явлении флуоресценции требуют использования специального оборудования и не могут быть использованы для быстрого визуального определения веществ.
Высокой специфичностью обладают методы, использующие аптамеры – молекулы нуклеиновых кислот, способные узнавать и связывать определенные молекулы-мишени. Так, в работе [[48]] описывается высокоспецифичный способ анализа молока на присутствие ХАФ с пределом определения 9,7 нг/мл.
Электрохимические методы анализа ХАФ не столь многочисленны, но они существуют. В работе [[49]] сообщается о разработке метода определения ХАФ с использованием электрода на основе MoS2 с пределом обнаружения 4,8 нг/мл.
В настоящее время на российском рынке представлено довольно большое количество экспресс-тестов как для определения только ХАФ в молоке и других продуктах питания, например, «Chloramphenicol rapid test» (Nankai Biotech Co., Ltd., Китай) [[50]], так и для одновременного определения 4 антибиотиков – бета-лактамов, тетрациклина, хлорамфеникола и стрептомицина [[51]]. Предел обнаружения хлорамфеникола в этих тестах составляет 0,3 нг/мл. Все они в основном импортного производства и, соответственно, достаточно дороги, цены варьируются примерно от 200-300 рублей до 50 Е за 1 тест. В связи с этим разработка отечественных экспресстестов для определения остаточных количеств антибиотиков в продуктах питания представляет важную задачу.
3 Экспериментальная часть
3.1 Химические реагенты и биологические препараты
В работе использовали следующие реагенты: золотохлористоводородную кислоту (ЗХВК), Твин 20 («Fluka», Швейцария); хлорамфеникол, сукцинат хлорамфеникола, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хлорид , N–гидроксисукцинимид, бычий сывороточный альбумин (БСА), цитрат натрия («Sigma», США); диметилформамид (ДМФА), карбонат, азид, хлорид натрия; одно- и двузамещенные фосфаты калия, сахарозу («Химмед», Россия), поликлональные антитела к ХАФ, белок А стафилококка (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия).
В мультимембранных тест-полосках для иммунохроматографии использовали следующие мембраны:
· аналитические нитроцеллюлозные мембраны – CNPC (размер пор 15 µ) (MDI, Индия);
· мембраны для нанесения конъюгата – РТ-5 (MDI, Индия));
· мембраны для нанесения образца – GFB-R7L, GFB-R4, (MDI, Индия), MAPDS-0300 (Arista Biologicals, США);
· абсорбирующая мембрана – АР045 (MDI, Индия).
Образцы молока были взяты из торговой сети.
3.2 Оборудование
Измерение рН проводили на рН-метре фирмы «Mettler-Toledo» (Швейцария) с точностью до 0,02 ед. рН, измерение рН растворов коллоидного золота проводили с использованием рН-полосок фирмы Fisher (США) с диапазоном определения рН от 5 до 9 единиц.
Навески реагентов взвешивали на электронных весах «Mettler-Toledo» (Швейцария) с точностью до 0,1 мг.
Измерения оптического поглощения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1202 («Shimadzu», Япония).
Нанесение конъюгатов ХАФ с БСА на мембрану производили при помощи автоматического диспенсера бесконтактного типа BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США).
Для резки тест-полосок использовали резак гильотинового типа Index Cutter-I, (A-Point Technologies, США).
Центрифугирование производили, используя Eppendorf 5810R (Eppendorf, Германия).
Для количественного определения интенсивности окраски аналитической и контрольных зон тест-полоски использовали сканер Epson Perfection V700 Photo (Seiko-Epson, Япония) с разрешением 600 точек на дюйм в 24-битном цвете (RGB). Анализ полученных цифровых изображений (в формате .tif) проводили с использованием программы Scion Image.
Размер частиц золота и золотых нанооболочек определяли на кафедре криоэлектроники Физического факультета МГУ на сканирующем электронном микроскопе фирмы Carl Zeiss (Германия).
3.3 Приготовление растворов
Все растворы готовили на деионизованной воде Milli-Q («Millipore», Франция).
Использовали следующие буферные растворы:
· 0,01 М К-фосфатный, рН=7,4 (ФБ);
· 0,01 М К-фосфатный, 0,15 М NaCl, рН=7,4 (ФБС);
· 0,01 М К-фосфатный, 0,15 М NaCl, 0,1% твин 20, рН=7,4 (ФБСТ).
Стандартные растворы ХАФ для анализа с концентрациями 0; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 нг/мл готовили в ФБСТ или молоке из исходного раствора ХАФ (1000 нг/мл в ФБС).
Рабочие растворы конъюгатов ХАФ-БСА и белка А с выбранными концентрациями готовили в ФБС.
3.4 Методы исследований
3.4.1 Получение конъюгатов сукцината ХАФ с БСА (ХАФ-БСА)
4 мг сукцината ХАФ растворяли в 100 мкл ДМФА. При перемешивании к полученному раствору добавляли 200 мкл раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид хлорида (EDCl, 5 мг) и 100 мкл раствора N–гидроксисукцинимида (3 мг). Реакционную смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре.
Затем активированное производное сукцината ХАФ добавляли к 1 мл раствора БСА (10 мг/мл в ФБС; 0,145 мкмоль) из расчёта 2,9 мкмоль (129 мкл) и 0,725 мкмоль (32 мкл). Перемешивали 1 час при комнатной температуре и оставляли на ночь при температуре 4˚С. Полученные растворы конъюгатов ХАФ-БСА диализовали дважды против 2 л ФБС.
3.4.2 Получение наночастиц золота
Наночастицы золота получали по методу Френса [27]. К 200 мл кипящего 0,01%-го раствора золотохлористоводородной кислоты добавляли при перемешивании 4,2 мл 1% -го водного раствора цитрата натрия. После этого полученный раствор кипятили еще 15 минут. Раствор охлаждали в тёмном месте и измеряли спектр поглощения в диапазоне длины волны 400-600 нм.
3.4.3 Получение конъюгата наночастиц золота с антителами
К 1 мл раствора коллоидного золота с pH 7,0-7,5 (10 мкл/мл 0,1 М раствора Na2CO3) добавляли по каплям 100 мкл раствора антител (0,22 мг/мл в деионизованной воде), перемешивали 30 минут при комнатной температуре. После чего добавляли 20% раствор БСА до конечной концентрации 0,2%, выдерживали 20 минут при комнатной температуре, затем вводили 50% раствор сахарозы (до 10%) и азид натрия (до 0,01%) и хранили при температуре +4˚С.
Для удаления несвязавшихся антител конъюгат центрифугировали (30 мин, 11000g, 4˚С). Супернатант удаляли, осадок перерастворяли в требуемом объеме ФБ, содержащего 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия. Полученный раствор наносили на полоску стекловолоконной мембраны 4×4 мм из расчета 5 мкл на полоску.
3.4.4 Изготовление иммунохроматографической тест-полоски
На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану CNPC(15µ) наносили раствор конъюгата ХАФ-БСА в выбранной концентрации в ФБС с помощью программируемого автоматического диспенсера BioDot XYZ 3050 (BioJet Quanti 3000, BioDot, США) для формирования аналитической зоны. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 5 мм от аналитической наносили раствор белка А с концентрацией 1 мг/мл в ФБС. Использовали следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000 для нанесения образцов: размер капли – 30 нл, шаг – 0,3 мм, скорость – 50 мм/сек. Полоски высушивали при температуре 37˚С (относительная влажность 25-30%) в течение 24 ч и хранили при комнатной температуре в герметично закрытой упаковке.
Растворы конъюгатов антител с наночастицами коллоидного золота наносили на мембраны РТ-5 и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Собирали тест-полоски в соответствии со схемой на рис. 1.
3.4.5 Проведение иммунохроматографического анализа
Конец тест-полоски с мембраной для образца погружали в лунки полистиролового планшета с анализируемым раствором объема 180 мкл. Через 10 минут тест-полоски доставали, помещали на белый лист бумаги и высушивали, визуально оценивая результат теста.
Для количественной оценки результатов анализа тест-полоски сканировали на планшетном сканере Epson Perfection V700 Photo (Seiko-Epson, Япония), полученные в виде графических файлов (.tif) изображения обрабатывали с помощью программы Scion Image, определяли интенсивность окраски полос в аналитической зоне (в виде условных единиц) и строили градуировочные зависимости интенсивности полос от концентрации. ХАФ
3.5 Определение аналитических характеристик
При выявлении промахов использовали тест Граббса и Q-критерий.
Предел обнаружения определяли как концентрацию, соответствующую значению интенсивности сигнала градуировочной кривой
За предел определения принимали концентрацию, соответствующую значению интенсивности сигнала градуировочной кривой , где , – значение интенсивности сигнала каждого измерения пробы при отсутствии аналита, – среднее значение интенсивности сигнала пробы при отсутствии аналита, n – количество измерений (n=10).
Предел обнаружения при визуальной регистрации определяли как минимальную концентрацию антибиотика, при которой не наблюдается окрашенной линии в тестовой зоне.
Воспроизводимость анализа. Проводили по пять повторных измерений стандартных растворов ХАФ. Рассчитывали стандартное отклонение и относительное стандартное отклонение для каждого раствора по формуле:
.
4 Результаты и их обсуждение
При разработке тест-системы для определения хлорамфеникола использовали непрямую схему конкурентного иммунохроматографического анализа с конъюгатом ХАФ-БСА и мечеными наночастицами золота поликлональными антителами против ХАФ (рис. 3). В присутствии определяемого антигена (ХАФ) в образце по мере продвижения вдоль полоски происходит образование комплекса антигена с мечеными наночастицами золота специфическими антителами (Ат-НЧЗ), сорбированными на стекловолоконной мембране. Далее образовавшийся иммунокомплекс под действием капиллярных сил движется в направлении тестовой зоны с иммобилизованным конъюгатом ХАФ-БСА. В случае образования комплекса между специфическими антителами, мечеными НЧЗ, с иммобилизованным в составе конъюгата ХАФ-БСА хлорамфениколом наблюдается появление окрашенной полосы, интенсивность которой уменьшается при увеличении концентрации ХАФ в образце. При отсутствии в исследуемом образце ХАФ меченые золотом антитела связываются с максимальной интенсивностью в тестовой зоне. Избыток несвязавшихся меченых антител образует вторую окрашенную полосу с иммобилизованым белком А в контрольной зоне.
4.1 Получение иммунореагентов
Первоочередная задача в ходе разработки метода ИХА для определения ХАФ состояла в получении иммунохимических реагентов. Для иммобилизации в тестовой зоне синтезировали конъюгаты сукцината ХАФ с БСА (в соотношении 20:1 и 5:1) по методу активированных эфиров (с использованием водорастворимого карбодиимида и N-гидроксисукцинимида). Метод включает в себя активацию карбоксильной группы сукцината ХАФ путем образования N-гидроксисукцинимидного эфира и взаимодействия последнего с аминогруппой лизина белка с образованием пептидной связи (рис. 5).
Рис. 5. Схема синтеза конъюгата ХАФ-БСА
Выбор данного метода синтеза конъюгатов обусловлен тем, что, по сравнению с использованием одного карбодиимида, он дает меньше побочных продуктов и обеспечивает более высокий выход продукта за счет формирования лучшей уходящей группы и более стабильного промежуточного продукта. Для иммобилизации использовали концентрацию полученных конъюгатов 0,5 мг/мл в ФБС.
Раствор коллоидного золота получали путем восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия по методу Френса [27]. Наночастицы золота, полученные в данной работе, по данным электронной сканирующей микроскопии, имели средний размер 21 нм и пик поглощения 521 нм (рис. 6).
Рис. 6. Спектр наночастиц золота
С этими НЧЗ получали конъюгаты со специфическими антителами. Сорбция антител на поверхности наночастиц способствует их стабилизации, препятствуя их коагуляции. При этом антитела сохраняют свою способность связываться с антигеном. Ранее были подобраны оптимальные условия сорбции антител, при которых НЧЗ стабильны при увеличении ионной силы раствора: рН 7,0-7,5, концентрация 20 мкг/мл золя.
К чувствительности определения остаточных количеств ХАФ в продуктах питания предъявляются высокие требования. Уменьшение концентраций специфических иммунореагентов часто приводит к увеличению чувствительности в конкурентных схемах анализа. С этой целью получили 3 конъюгата НЧЗ с антителами, где специфические к ХАФ антитела составляли 100%, 50% и 25% от общего количества антител. Для сохранения необходимой для стабилизации НЧЗ концентрации белка использовали "балластные" (не связывающие ХАФ) антитела. Предполагалось, что это может влиять на эффективность конкуренции связывания меченых золотом антител как свободного ХАФ в определяемой пробе, так и сорбированного в составе конъюгата с БСА в тестовой зоне.
4.2 Разработка иммунохроматографической тест-системы для определения ХАФ
Разработка тест-системы происходила в несколько этапов. На первом из них изучали влияние количества сорбированных специфичных к ХАФ антител на поверхности наночастиц золота и состава конъюгата ХАФ-БСА на аналитические характеристики метода.
Для этого сравнивали интенсивности сигналов при концентрациях хлорамфеникола 0 и 1 нг/мл в ФБСТ. Концентрации иммунореагентов были одинаковы. Результаты приведены на рис. 7.
Рис. 7. Зависимость интенсивности сигнала от состава иммунореагентов
Чтобы понять, во сколько раз изменяется интенсивность при повышении концентрации ХАФ от нуля до единицы, считали отношение I1/I0, где I1 – интенсивность сигнала при концентрации ХАФ 1нг/мл, а I0 – интенсивность сигнала при отсутсвии ХАФ в растворе. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Отношение I1/I0 для различных составов
Для разработки количественного метода выбрали два варианта соотношений реагентов – конъюгат ХАФ-БСА 20:1 с конъюгатом АТ-НЧЗ 50% и ХАФ-БСА 5:1 с Ат-НЧЗ 100%. Эти варианты показали cхожие результаты. Критериями выбора служили наибольшая разница между интенсивностями сигналов для концентраций 1 и 0 нг/мл (сотношение I1/I0 должно быть минимальным), но при этом интенсивность сигнала должна быть не менее 20-25 усл.ед., поскольку низкие сигналы могут приводить к увеличению ошибки эксперимента.
Отношения I1/I0 для 25% конъюгатов наночастиц золота с антителами наименьшие, но ввиду низкой интенсивности аналитического сигнала при отсутствии ХАФ в растворе, в дальнейшем для разработки количественного метода эти варианты не рассматривали. Для конъюгата ХАФ-БСА 5:1 и 50% состава Ат-НЧЗ также наблюдалась недостаточно высокая интенсивность сигнала при низких содержаниях ХАФ в аналите. Все эти варианты можно рассмотреть в дальнейшем для разработки качественного теста для определения хлорамфеникола.
Среди оставшихся составов исключили самый первый – ХАФ-БСА 20:1, Ат-НЧЗ 100%, поскольку при концентрации 1 нг/мл ХАФ он имел слишком высокую интенсивность, а отношение I1/I0 велико по отношению с остальными.
Для выбранных вариантов получили градуировочные зависимости в буферном растворе и рассчитали аналитические характеристики (рис. 7, таблица 2).
Рис. 8. Градуировочные зависимости для определения ХАФ в ФБСТ
Таблица 2. Аналитические характеристика метода ИХА хлорамфеникола
Таким образом, была разработана тест-ситема для количественного определения ХАФ в буферном растворе методом ИХА, предел обнаружения которой сравним с литературными данными [17, 42, 43] и позволяет определять остаточные количества ХАФ ниже установленного критерия MRPL (0,3 нг/мл), даже при разбавлении образцов молока. Пределы обнаружения при визуальной регистрации составил порядка 2-3 нг/мл. Метод харатеризуется хорошей воспроизводимостью результатов анализа, относительное стандартное отклонение для стандартных растворов ХАФ не превышало 10%. Оба варианта показали схожие аналитические характеристики, при выборе конечного состава руководствовались экономическими факторами: для состава ХАФ-БСА 20:1, 50% требуется в два раза меньше антител, из-за чего стоимость тест-ситемы будет ниже.
4.3 Определение хлорамфеникола в молоке.
Задача настоящей работы заключалась в создании тест-системы для определения остаточных количеств ХАФ в цельном молоке.
Прежде всего необходимо было подобрать условия для свободного протекания анализируемого образца вдоль тест-полоски, поскольку молоко является достаточно сложной биологической жидкостью, и в неразбавленном виде плохо течет по мембране. Для проведения анализа молоко разбавляли в 4 раза ФБСТ (разбавление молока в 2 раза было недостаточным), предел обнаружения разработанного метода позволяет это делать.
Рис. 9. Градуировочные зависимости в молоке (1:3 в ФБСТ) и в буферном растворе
Из градуировочных зависимостей на рис. 9 видно, что кривые, полученные на основе стандартных растворов ХАФ в буферном растворе и на основе стандартов ХАФ в разбавленном молоке (3,2%, Домик в деревне) сильно расходятся. Такое явление объясняют наличием матричного эффекта, подразумевая под этим влияние состава анализируемой жидкости на интенсивность сигнала. В молоке содержится множество белков и жиров, которые могут оказывать существенное влияние на результаты анализа.
Существует два основных подхода для преодоления матричного эффекта – это простое разбавление образцов буферным раствором, что в данном случае не привело к желаемому результату.
Второй способ – использование специальных мембран для нанесения образца. Используемая в предыдущих экспериментах мембрана MAPDS-0300 изготовлена из стекловолокна и не содержит в своем составе дополнительных реагентов. В работе протестировали мембраны для нанесения образца – GFB-R7L и GFB-R4, изготовленные из целлюлозного волокна и отличающиеся между собой методами предобработки. Мембрана GFB-R4 не содержит в своем составе дополнительных веществ, а в составе GFB-R7L присутствуют соли и детергенты.
Полученные результаты представлены на рис. 10.
Рис. 10. Сравнение интенсивности сигнала в буферном растворе и разбавленном молоке (1:3 в ФБСТ) в зависимости от используемой мембраны
Опираясь на данные гистограммы, для определения ХАФ в молоке наиболее подходит мембрана GFB-R7L. Интенсивности сигналов были наиболее близки в буферном растворе и молоке для 0 и 1 нг/мл ХАФ. Вероятно, присутствие в ее составе дополнительных реагентов улучшает капиллярное течение молока, уменьшая тем самым матричный эффект.
Таким образом, для определения ХАФ в молоке необходимо предварительно разбавлять образцы молока в 4 раза буферным раствором и использовать мембрану для нанесения образца GFB-R7L.
5 Выводы
В ходе проведённых исследований:
- получены специфические иммунореагенты разного состава: конъюгат хлорамфеникола с бычьим сывороточным альбумином (ХАФ-БСА) и конъюгат специфических антител с наночастицами золота (Ат-НЧЗ);
- установлено, что оптимальные соотношения составов иммунореагентов: ХАФ-БСА 20:1, Ат-НЧЗ 50% и ХАФ-БСА 5:1, Ат-НЧЗ 100%;
- разработана методика определения ХАФ в буферном растворе методом ИХА, пределы обнаружения и определения составили 0,04 нг/мл и 0,06 нг/мл, соответственно; относительное стандартное отклонение не превышало 10%;
- показано, что для определения ХАФ в молоке лучше использовать мембрану GFB-R7L, а молоко следует предварительно разбавить в 4 раза буферным раствором.
6 Список литературы
[1]. Zhang G., Guo J., Wang X. Immunochromatographic Lateral Flow Strip Tests // Methods Mol. Biol. 2009. V. 504. P. 169—183. (doi:10.1007/978-1-60327-569-9_12)
[2]. Posthuma-Trumpi G., Korf J., van Amerongen A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey // Anal. Bioanal.Chem. 2009. V. 393. №2. P. 569—582.
[3]. Егоров Н.С. Основные учения об антибиотиках. М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. С. 528.
[4]. Wilson R. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection // Chem. Soc. Rev. 2008. V. 37. P. 2028—2041.
[5]. Wong R C, Tse H.Y. Lateral Flow Immunoassay. NY USA: Humana Press, 2009. P. 223.
[6]. Морозова В.С., Габрильянц О.А., Мягкова М.А. Диагностика и профилактика заболеваний зависимости. М.: Академия Естествознания, 2015. С. 177.
[7]. https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/tb500en00em-rapid-lateral-flow-test-strips.pdf
[8]. Khreich N., Lamourette P., Boutal H., Devilliers K., Creminon C., Volland H. Detection of Staphylococcus enterotoxin B using fluorescent immunoliposomes as label for immunochromatographic testing // Anal. Biochem. 2008. V. 377. №2. P. 182—188.
[9]. Edwards K.A., Baeumner A.J. Optimization of DNA-tagged dye-encapsulating liposomes for lateral-flow assays based on sandwich hybridization // Anal. Bioanal.Chem. 2006. V. 386. №5. P. 1335—1343.
[10]. Van Amerongen A., Wichers J.H., Berendsen L.B.J.M., Timmermans A.J.M., Keizer G.D., van Doorn A.W.J., Bantjes A. van Gelder W.M.J. Colloidal carbon particles as a new label for rapid immunochemical test methods: Quantitative computer image analysis of results // J. Biotechnol. 1993. V. 30. №2. P.185—195.
[11]. Goryacheva I.Y., Lenain P., De Saeger S. Nanosized labels for rapid immunotests // TrAC, Trends Anal. Chem. 2013. V. 46. P 30—43.
[12]. Linares E.M., Kubota L.T., Michaelis J., Thalhammer S. Enhancement of the detection limit for lateral flow immunoassays: Evaluation and comparison of bioconjugates // J. Immunol. Methods. 2012. V. 375. №1-2. P. 264—270.
[13]. Hagan A.K., Zuchner T. Lanthanide-based time-resolved luminescence immunoassays // Anal. Bioanal.Chem. 2011. V. 400. №9. P. 2847—2864.
[14]. Sund H., Blomberg K., Meltola N., Takalo H. Design of Novel, Water Soluble and Highly Luminescent Europium Labels with Potential to Enhance Immunoassay Sensitivities // Molecules. 2017. V. 22. №10. P. 1807.
[15]. Obonyo O., Fisher E., Edwards M., Douroumis D. Quantum dots synthesis and biological applications as imaging and drug delivery systems // Crit. Rev. Biotechnol. 2010. V. 30. №4. P. 283—301.
[16]. Jahangir M.A., Gilani S.J., Muheem A., Jafar M., Aslam M., Ansari M.T., Abul Barkat M. Quantum Dots: Next Generation of Smart Nano-Systems // Pharm. Nanotechnol. 2019. V. 7. №3. P. 234—245.
[17]. Taranova N.A., Berlina A.N., Zherde v A.V., Dzantiev B.B. “Traffic light” immunochromatographic test based on multicolor quantum dots for the simultaneous detection of several antibiotics in milk // Biosens. Bioelectron. 2015. V. 63. P. 255—261.
[18]. Stults N. L., Stocks N.F., Rivera H., Gray J., McCann R.O., O’Kane D., Cummings R.D., Cormier M.J., Smith D.F. Use of recombinant biotinylated aequorin in microtiter and membrane-based assays: Purification of recombinant apoaequorin from Escherichia coli // Biochemistry. 1992. V. 31. №5. P. 1433—1442.
[19]. Liotta L.A., Christiansen B.C., Day A.R., Harlacher T., Paweletz K. Light emitting immunoassay. №US patent 5942407. Application 08/882594 from 25.06.1997, publ. 24.08.1999.
[20]. Wang Y., Xu H., Wei M., Gu H., Xu Q., Zhu W. Study of superparamagnetic nanoparticles as labels in the quantitative lateral flow immunoassay // Mater. Sci. Eng., C. 2009. V. 29. №3. P. 714—718.
[21]. Connolly R., O’Kennedy R. Magnetic lateral flow immunoassay test strip development – Considerations for proof of concept evaluation // Methods (Amsterdam, Neth.). 2017. V. 116. P. 132—140.
[22]. Mohamad Nor N., Abdul Razak K., Tan S.C., Noordin R. Properties of surface functionalized iron oxide nanoparticles (ferrofluid) conjugated antibody for lateral flow immunoassay application // J. Alloys Compd. 2012. V. 538. P. 100—106.
[23]. Madison R., Maklins J.D. Latex nanospheres delivery systems // Brain Res. 1990. V. 7. №3. P. 187—192.
[24]. Ling S., Li X., Zhang D., Wang K., Zhao W., Zhao Q., Wang R., Yuan J., Xin S., Wang S. Detection of okadaic acid (OA) and tetrodotoxin (TTX) simultaneously in seafood samples using colloidal gold immunoassay // Toxicon. 2019. V. 165. P. 103—109.
[25]. Дыкман Л.Г., Богатырев В.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии. // Успехи химии. 2007. Т. 76. №2. С. 199—213.
[26]. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.Г., Хлебцов Б.Н. Плазмонно-резонансные наночастицы для биодиагностики и медицины.// Нанотехника. 2007. №2. С. 77—80.
[27]. Frens G. Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions // Nature (London), Phys. Sci. 1973. V. 241. №105. P. 20—22.
[28]. https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/PDF/?uri=CELEX:32003D0181&from=LV (19.05.2020)
[29]. https://sudact.ru/law/reshenie-soveta-evraziiskoi-ekonomicheskoi-komissii-ot-09102013_3/tr-ts-0332013/prilozhenie-n-4/ (19.05.2020)
[30]. Ding S., Shen J., Zhang S., Jiang H., Su Z. Determination of Chloramphenicol Residue in Fish and Shrimp Tissues by Gas Chromatography with a Microcell Electron Capture Detector // J. AOAC Int. 2005. V. 88. №1. P. 57—60.
[31]. Sanchez-Brunete C., Albero B., Miguel E., Tadeo J.L. Rapid Method for Determination of Chloramphenicol Residues in Honey Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2005. V. 75. №3. P. 459—465.
[32]. Guidi L. R., Tette P.A.S., Fernandes C., Silva L.H.M., Gloria M.B.A. Advances on the chromatographic determination of amphenicols in food // Talanta. 2017. V. 162. P. 324—338.
[33]. Xie Y., Hu Q., Zhao M., Cheng Y., Guo Y., Qian H., Yao W. Simultaneous Determination of Erythromycin, Tetracycline, and Chloramphenicol Residue in Raw Milk by Molecularly Imprinted Polymer Mixed with Solid-Phase Extraction // Food Anal. Methods. 2017. V. 11. №2. P. 374—381.
[34] .Han J., Wang Y., Yu C., Yan Y., Xie X. Extraction and determination of chloramphenicol in feed water, milk, and honey samples using an ionic liquid/sodium citrate aqueous two-phase system coupled with high-performance liquid chromatography // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 399. №3. P. 1295—1304.
[35]. Tu C., Guo Y., Dai Y., Wei W., Wang W., Wu L., Wang A. Determination of Chloramphenicol in Honey and Milk by HPLC Coupled with Aptamer-Functionalized Fe3O4/Graphene Oxide Magnetic Solid-Phase Extraction // J. Food Sci. 2019. V. 84. №12. P. 3624—3633.
[36]. Wang H., Zhou X.-J., Liu Y.-Q., Yang H.-M., Guo Q.-L. Simultaneous Determination of Chloramphenicol and Aflatoxin M1Residues in Milk by Triple Quadrupole Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry // J. Agric. Food Chem. 2011. V. 59. №8. P. 3532—3538.
[37]. Wang L., Zhang Y., Gao X., Duan Z., Wang,S. Determination of Chloramphenicol Residues in Milk by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Improvement by Biotin−Streptavidin-Amplified System // J. Agric. Food Chem. 2010. V. 58. №6. P. 3265—3270.
[38]. Chughtai M.I., Maqbool U., Iqbal M., Shah M.S., Fodey T. Development of in-house ELISA for detection of chloramphenicol in bovine milk with subsequent confirmatory analysis by LC-MS/MS // J. Environ. Sci. Health, Part B. 2017. V. 52. №12. P. 871—879.
[39]. Scortichini G., Annunziata L., Haouet M.N., Benedetti F., Krusteva I., Galarini R. ELISA qualitative screening of chloramphenicol in muscle, eggs, honey and milk: method validation according to the Commission Decision 2002/657/EC criteria // Anal. Chim. Acta. 2005. V. 535. №1-2. P. 43—48.
[40]. Федорова М.Д., И.П.Андреева И.П., Вылегжанина Е.С., Комаров А.А., Рубцова М.Ю., Самсонова Ж.В., Егоров А.М. Иммуноферментный анализхлорамфеникола в продуктах питания // Биотехнология. 2009. №6. С. 79—87.
[41]. Zhang S., Zhang Z., Shi W., Eremin S.A., Shen J. Development of a Chemiluminescent ELISA for Determining Chloramphenicol in Chicken Muscle // J. Agric. Food Chem. 2006. V. 54. №16. P. 5718—5722.
[42]. Byzova N.A., Zvereva E.A., Zherdev,A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Rapid pretreatment-free immunochromatographic assay of chloramphenicol in milk // Talanta. 2010. V. 81 №3. P. 843—848.
[43]. Zhou J., Nie W., Chen Y., Yang C., Gong L., Zhang C., Chen Q., He L., Feng, X. Quadruplex gold immunochromatogaraphic assay for four families of antibiotic residues in milk // Food Chem. 2018. V. 256. P. 304—310.
[44]. Hendrickson O.D., Zvereva E.A., Shanin I.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Development of a multicomponent immunochromatographic test system for the determination of fluoroquinolone and amphenicol antibiotics in dairy products // J. Sci. Food Agric. 2019. V. 99. №8. P. 3834—3842.
[45]. Berlina A.N., Taranova N.A., Zherdev A.V., Vengerov Y.Y., Dzantiev B.B. Quantum dot-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk // Anal. Bioanal. Chem. 2013. V. 405. №14. P. 4997—5000.
[46]. Qie Z., Yan W., Gao Z., Meng W., Xiao R., Wang S. An anti-BSA antibody-based immunochromatographic assay for chloramphenicol and aflatoxin M1 by using carboxy-modified CdSe/ZnS core–shell nanoparticles as label // Microchim. Acta. 2020. V. 187. №1.
[47]. Liu S., Bai J., Huo Y., Ning B., Peng Y., Li S., Han D, Kang W, Gao Z. A zirconium-porphyrin MOF-based ratiometric fluorescent biosensor for rapid and ultrasensitive detection of chloramphenicol // Biosens. Bioelectron. 2019. Pre-proof.
[48]. Javidi M., Housaindokht M.R., Verdian A., Razavizadeh B.M. Detection of chloramphenicol using a novel apta-sensing platform based on aptamer terminal-lock in milk samples // Anal. Chim. Acta. 2018. V. 1039. P. 116—123.
[49]. Govindasamy M., Chen S.-M., Mani V., Devasenathipathy R., Umamaheswari R., Joseph Santhanaraj K., Sathiyan, A. Molybdenum disulfide nanosheets coated multiwalled carbon nanotubes composite for highly sensitive determination of chloramphenicol in food samples milk, honey and powdered milk // J. Colloid Interface Sci. 2017. V. 485. P. 129—136.
[50]. https://www.made-in-china.com/factory/chloramphenicol-rapid-test.html (24.05.2020)
[51]. http://тесты-антибиотики.рф (24.05.2020)