Biopelícula en Staphylococcus aureus sensibles y resistentes a meticilina

Biofilm in methicillin sensitive and resistant Staphylococcus aureus

• Ávila-Roo Yeiny. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0001-5105-033X. Laboratorio de Bacteriología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia. Calle 65 con Av. 19. Edificio Ciencia y Salud, Maracaibo. Venezuela. Teléfono: +058-4246812465. E-mail: yavila@fmed.luz.edu.ve

• Ginestre-Pérez. Messaria. Cátedra Bacteriología General. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: messaria@hotmail.com

• Castellanos-Tolosa María. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: mariandre2910@gmail.com

• Escobar-Velásquez Franci. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: escobar.franci@gmail.com

• Briceño-Peñaloza Amarilis. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: amarilis_danger@hotmail.com

• Valero-Leal. Kutchynskaya. Cátedra Bacteriología Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: kutchynskaya@gmail.com

• Rincón-Villalobos Gresleida. Cátedra Bacteriología Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: gresle61@hotmail.com

• Rivera-Salazar Jhoandry. Laboratorio de Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: jhoandriveras@gmail.com

Recibido: 05/11/2018; Aceptado: 04/03/2019; Publicación en línea: 18/03/2019

Resumen

La formación de biopelícula es una estrategia de vida para la mayoría de las bacterias, ya que aumenta las posibilidades de transferencia de material genético y la resistencia a antibióticos, participa en la comunicación celular y ofrece protección en condiciones adversas y variables del medio ambiente; lo que contribuye a una colonización exitosa del hospedador. Esta investigación se propuso determinar la capacidad de producir biopelícula en aislamientos de S. aureus. Se estudiaron 30 aislados (13 sensibles y 17 resistentes a meticilina) mediante ensayo sobre microplacas de cultivos celulares. Todas las cepas mostraron patrones de adherencia; 24 (80%), 4 (13%) y 2 (7%) exhibieron grados de adherencia moderado, débil y fuerte, respectivamente. 77% de las cepas sensibles resultaron moderadamente productoras, 13% débiles y 7% fuertes productoras de biopelícula. Las cepas resistentes presentaron mayormente moderada producción (82%) y el 18% débil producción. No hubo asociación entre el grado de adherencia y la susceptibilidad a la meticilina. La alta tasa de producción de biopelícula en cepas clínicas de S. aureus, sensibles y resistentes a meticilina, sugiere el peligro potencial que representan dichas cepas dentro y fuera de ambientes hospitalarios, dada la importancia que juegan las biopelículas en el desarrollo de infecciones crónicas.

Palabras claves: Staphylococcus aureus, biopelícula, resistencia a la meticilina.

Abstract

The formation of biofilm is a life strategy for most bacteria, since it increases the possibilities of transfer of genetic material and resistance to antibiotics, participates in cellular communication and offers protection in adverse and variable environmental conditions; what contribute to a successful colonization of the host. This research aimed to determine the capacity to produce biofilm in isolates of S. aureus. Thirty isolates (13 sensitive and 17 resistants to methicillin) were studied by assay on cell culture microplates. All strains showed adherence patterns; 24 (80%), 4 (13%) and 2 (7%) exhibited degrees of moderate, weak and strong adhesion, respectively. 77% of sensitive strains were moderately productive, 13% weak and 7% strong producers of biofilm. The resistant strains presented a moderate production (82%) and 18% a weak production. There was no association between the degree of adherence and the susceptibility to methicillin. The high rate of biofilm production in clinical strains of S. aureus, sensitive and resistant to methicillin, suggests the potential danger posed by such strains inside and outside hospital environments, given the importance that biofilms play in the development of chronic infections.

Keywords: Staphylococcus. aureus, biofilm, methicillin resistant

Introducción

Varias especies bacterianas patógenas que se encuentran en el medio ambiente son capaces de formar una estructura multicelular compleja en las superficies, conocida como biopelícula o biofilm. Las biopelículas protegen las células no sólo de la respuesta inmunitaria del hospedero, sino también de agentes antimicrobianos (1). Una biopelícula es un conjunto de células microbianas asociadas a la superficie, que está encerrado en una matriz de sustancia polimérica extracelular. Las bacterias incrustadas en un biofilm son más resistentes a los antimicrobianos a través de varios mecanismos: la penetración total de antimicrobianos es pobre, dependiente del crecimiento, tienen una eficacia menor debido a la disminución del metabolismo de las bacterias y el intercambio de genes de resistencia es más fácil por la proximidad de las células. La formación de células persistentes, una subpoblación de bacterias que sobreviven al tratamiento antimicrobiano, es también un factor contribuyente (2-4).

Las infecciones relacionadas con biopelículas, característicamente infecciones crónicas, persistentes, refractarias a tratamiento antimicrobiano, son un importante problema sanitario ya que representan entre un 65 y un 80% de todas las infecciones. Estas se pueden localizar en casi cualquier tejido del cuerpo humano, destacando la infección crónica de piel y partes blandas, las infecciones pulmonares en los pacientes con fibrosis quística o bronquiectasias o la endocarditis. Además, las biopelículas causan infecciones relacionadas con diversos dispositivos biomédicos. En general, estas infecciones son difíciles de diagnosticar y tratar, existiendo en la actualidad muchas dudas en cuanto a la estrategia terapéutica óptima para estos pacientes (5).

Staphylococcus aureus es una causa común de infecciones mediadas por la formación de biofilm, asociadas con catéteres intravenosos, válvulas cardíacas artificiales y articulaciones protésicas. La habilidad de este patógeno nosocomial para formar biopelículas es de interés clínico, ya que la formación de biopelículas lo hace más resistente a los antibióticos y a las defensas del hospedero, por lo tanto, influye en el resultado posterior de la infección. Además, los dispositivos colonizados pueden convertirse en focos importantes y pueden causar infecciones localizadas y generalizadas (6).

Staphylococcus aureus ha asegurado su éxito como un patógeno importante en todo el mundo a través de su versatilidad, factores de virulencia y mecanismos de resistencia. Las infecciones invasivas por S. aureus tienen una alta tasa de mortalidad y las producidas por S. aureus resistente a meticilina (SARM) tienen resultados aún peores (7). Es una bacteria considerada como oportunista, debido a que ocasiona enfermedades al humano, principalmente cuando éste atraviesa lapsos de vulnerabilidad asociados a circunstancias anómalas que disminuyen la competencia de su sistema inmunológico. Bajo tales condiciones, el microorganismo es capaz de provocar afecciones en casi cualquier región anatómica, lo cual refleja su amplio bagaje en cuanto a genes de virulencia que lo habilita para establecerse, reproducirse, sobrevivir y diseminarse en diversas clases de tejidos (8).

Se ha especulado que SARM pueda ser más virulento que S. aureus sensible a meticilina (SASM), pero no se ha podido demostrar por ahora. Incluso ciertos autores opinan lo contrario, ya que el gasto biológico que este cambio supone iría en detrimento de su virulencia. La superior mortalidad de SARM observada en algunos estudios, se ha relacionado con la mayor comorbilidad de los pacientes infectados, el retraso en el tratamiento adecuado y la menor disponibilidad de antibióticos apropiados para estos estafilococos (9).

El propósito de esta investigación fue conocer la habilidad para producir biopelícula de 30 cepas de S. aureus sensibles y resistentes a meticilina, aisladas de muestras clínicas de pacientes del Servicio autónomo Hospital Universitario de Maracaibo.

Métodos

Tipo y diseño de investigación: la presente es una investigación descriptiva con un diseño de campo no experimental, la cual consiste en la recolección de datos directamente de la realidad donde ocurren los hechos, sin manipulación deliberada de las variables.

Población y muestra: se estudiaron 30 cepas de S. aureus aisladas de diferentes tipos de muestras clínicas de pacientes del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM), tales cepas fueron caracterizadas genéticamente de acuerdo a la presencia o no del gen mecA (17 SARM y 13 SASM).

Metodología: a todas las cepas de S. aureus se les investigó la capacidad de producción de biopelícula, a través de un ensayo fenotípico cuantitativo utilizando un método sobre microplacas de cultivos celulares ⁽¹⁰⁾. Como cepa control positiva (productora de biopelícula) se utilizó la cepa S. aureus ATCC^® 25923.

Para cuantificar la adherencia, las microplacas se llevaron a un lector de ELISA (Biorad^®, modelo 680) para medir la densidad óptica de cada uno de los pozos, incluyendo el control negativo (DOc), a una longitud de onda de 630 nm (DO₆₃₀). Los valores promedios de DO₆₃₀ de los triplicados obtenidos de cada cepa, se consideraron como el índice de adherencia bacteriana.

Los intervalos discriminatorios para cuantificar el poder de adherencia y formación de biopelícula sobre las microplacas de cultivo de tejido celular se calcularon siguiendo los criterios de Manijeh y col. ⁽¹¹⁾, con ligeras modificaciones:

• En los casos donde se cumplió que DO₆₃₀ ≤ DOc; se consideró la cepa como no productora de biopelícula; cepas con valores ≤ 0,077

• En los casos donde se cumplió que DOc < DO₆₃₀ ≤ 2(DOc); se consideró la cepa como débil productora de biopelícula; cepas con valores entre 0,078 y 0,154.

• En los casos donde se cumplió que 2(DOc) < DO₆₃₀≤ 3(DOc); se consideró la cepa como moderadamente productora de biopelícula; cepas con valores entre 0,155 – 0,231.

• En los casos donde se cumplió que 3(DOc) < DO₆₃₀; se consideró la cepa como fuerte productora de biopelícula, cepas con valores ≥ 0,232

Análisis de Resultados: los datos obtenidos fueron analizados en forma porcentual, y organizados en tablas y gráficos. La asociación entre el grado de producción de biofilm y la susceptibilidad a la meticilina se determinó mediante la aplicación del estadístico c² con un grado de confiabilidad del 95%; por lo tanto, se consideraron estadísticamente significativos los valores de p iguales o inferiores a 0,05 (p≤0,05). Se empleó el Software estadístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versión 19.

Resultados

La cuantificación de la capacidad de adherencia de los 30 aislados clínicos de S. aureus utilizando el método sobre microplacas de cultivos celulares, mostró que la totalidad de las cepas (100%) presentó algún grado de producción de biopelícula.

La dispersión de los 30 aislamientos de S. aureus de acuerdo a la DO₆₃₀, se presenta en la Figura 1, clasificándose según el grado de adhesión en débil productoras (DP), moderadas productoras (MP) y fuertes productoras (FP) de biopelícula; así se observa que, 4 cepas se ubicaron dentro del espectro de débil producción con valores de DO entre 0,127 y 0,154; 2 cepas se mostraron como fuertes productoras ubicándose entre DO de 0,237 y 0,250 y 24 aislamientos registraron DO entre 0,155 y 0,220 clasificándose como moderadas productoras de biopelícula.

La Figura 2 muestra la distribución de las 30 cepas de S. aureus de acuerdo al grado de adhesión en las placas de poliestireno, observándose que, 80% (24) de los aislados mostraron un patrón de producción moderada, 13% (4) resultaron débil productoras y solo dos cepas (7%) se presentaron como fuertes productoras de biopelícula.

El número de cepas productoras de biofilm para cada grupo en estudio (SASM y SARM) puede observarse en la Figura 3, encontrándose que, las 13 cepas de SASM se distribuyeron de la siguiente manera: 1 (8%) DP, 10 (77%) MP y 2 (15%) FP; mientras que, los 17 aislados de SARM correspondieron a: 14 (82%) MP y 3 (18%) DP, respectivamente.

Al aplicar el estadístico X² para determinar si existía o no asociación significativa entre la susceptibilidad a la meticilina y el grado de producción de biopelícula, se obtuvo un valor p>0,05, lo cual indica que el grado de formación de biofilm no está asociado a la sensibilidad o resistencia a la meticilina.

En este estudio, tanto las cepas de SASM como las de SARM, mostraron tendencia a la producción moderada de biofilm, 77% y 82%, respectivamente (Figura 3).

Discusión

Las infecciones asociadas a biopelículas causadas por S. aureus son una causa importante de morbilidad y mortalidad (7). En este estudio, la totalidad de las cepas estudiadas mostraron algún patrón de adherencia a las placas de poliestireno. Este resultado coincide con lo reportado por otros autores, quienes en diferentes investigaciones con cepas clínicas de S. aureus informan porcentajes de formación de biopelículas que oscilan entre 83,3 y 100 % (12-20). Índices de adhesión inferiores en placas de poliestireno o formación de biopelículas, son reportados por otros investigadores. Así, Kwon y col. 2008 (21) al estudiar la producción de biopelículas en 101 aislamientos de S. aureus multidrogo-resistentes, se encontró que solo un 29,7 % de las cepas fueron capaces de formar biopelículas. Naicker y col. (2) y Khoramian y col. (22), obtuvieron 57 % y 58,4 % de positividad, respectivamente.

La distribución de las 30 cepas de S. aureus de acuerdo al grado de adhesión en las placas de poliestireno: 80% con patrón de producción moderada, 13% como débil productoras y 7% fuertes productoras, son resultados similares a los reportados por Rahimi y col. (23) y Smith y col. (15), quienes observaron un predominio de cepas de S. aureus con patrón de adhesión moderado en las placas de poliestireno; pero difieren de lo informado por Emaneini y col. (19) y Gad y col. (12) que consiguieron un mayor número de cepas con fuerte poder adherente; mientras que, Ávila y col. (18), al estudiar la producción de biopelículas en aislados clínicos de SARM, detectaron un mayor porcentaje de cepas con débil poder adherente; lo cual deja de manifiesto la gran variabilidad reportada en la literatura sobre la capacidad de los aislados clínicos de S. aureus, sensibles o resistentes a meticilina, para producir biopelículas en diferentes grados.

En cuanto a la relación de la susceptibilidad a la meticilina y la formación de biopelícula, pudo observarse que tanto las cepas de SASM como SARM, mostraron diversos grados de adhesión a las placas de poliestireno, encontrándose, para las 13 cepas de SASM: 1 (8%) DP, 10 (77%) MP y 2 (15%) FP; mientras que, para 17 aislados de SARM: 14 (82%) resultaron MP y 3 (18%) DP (Figura 3). Otros estudios (2,15,17) reportan hallazgos similares, observando patrones variados de producción de biopelícula, tanto en cepas sensibles como resistentes a meticilina. No se observó asociación significativa entre la susceptibilidad a la meticilina y el grado de producción de biopelícula, lo cual coincide con lo informado por Gil M. y col. (14), quien en una investigación para determinar la formación de biofilm en aislados clínicos de S. aureus según susceptibilidad y procedencia clínica, pudo constatar que no había asociación entre la susceptibilidad de las cepas a meticilina y el grado de formación de biopelícula. De igual forma, otros autores informan diferencias no significativas en la producción de biopelícula entre SASM y SARM (15,24,25).

En esta investigación, tanto las cepas de SASM como las de SARM, mostraron tendencia a la producción moderada de biopelícula, 77% y 82%, respectivamente. Gil M. y col. (14) reportan una mayor proporción de cepas de SASM débilmente formadoras de biopelícula; mientras que, las resistentes no mostraron una inclinación específica, ubicándose entre un grado débil y moderado.

La alta tasa de producción de biofilm en cepas clínicas de S. aureus, independientemente de la sensibilidad o resistencia a meticilina, sugieren el peligro potencial que representan dichas cepas dentro y fuera de ambientes hospitalarios, dada la implicación e importancia que juegan las biopelículas en el desarrollo de infecciones crónicas refractarias a terapias antimicrobianas.

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