Producción de biofilm y presencia de genes icaABCD en cepas de Staphylococcus aureus aisladas de leche cruda

Biofilm production and presence of genes icaABCD in Staphylococcus aureus strains isolated from raw milk .

Ginestre P, Messaria (1*); Ávila R, Yeiny (1); Valero L, Kutchynskaya (2); Rivera S, Jhoandry (3); Briñez Z, Wilfrido (4); Valeris C, Robert (5).

(1)Bacteriología General. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela. (2)Bacteriolgía Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela. (3)Departamento de Biología. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia-Venezuela. (4)Infectología Veterinaria. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad del Zulia-Venezuela. (5)Control de Calidad e Higiene de los Alimentos. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad del Zulia-Venezuela

Autor de correspondencia: Messaria Ginestre, e-mail: messaria@hotmail.com

Recibido: 26-04-2017 / Aceptado: 07-05-2017

Resumen

En la patogénesis de la mastitis estafilocócica, el biofilm se considera un marcador de virulencia que permite la adherencia del microorganismo al epitelio mamario. Con la finalidad de determinar la producción de biofilm y detectar la presencia de genes icaABCD, se analizaron 30 cepas de S. aureus aisladas de leche cruda obtenida de vacas con mastitis subclínica. El biofilm se determinó por el método cuantitativo sobre microplacas de cultivo celular y los genes icaABCD por reacción en cadena de la polimerasa. En 96,67% de las cepas de S. aureus se observó producción de biofilm. De éstas 43,34% fueron fuertes productoras, 30,00% moderadas productoras, 23,33% débiles productoras y 3,33% no productoras de biofilm. La totalidad de los genes icaADCD se obtuvo en 6,66% de los aislamientos. Todas las cepas, excepto una, presentaron icaA o icaD. En 56,66% de los aislamientos se identificaron genes icaA/icaD. En todas las cepas productoras de biofilm se identificaron genes del operón icaABCD, lo cual evidencia que poseen un factor de virulencia que facilita su persistencia en el tejido mamario. Además, el biofilm constituye una fuente de contaminación microbiana que puede conducir a fallas en los procesos de producción que generen problemas de inocuidad de los alimentos.

Palabras clave: Biofilm; S. aureus; genes ica; leche cruda

Abstract

In the pathogenesis of staphylococcal mastitis the biofilm is considered a marker of virulence that allows the adhesion of the microorganism to the mammary epithelium. In order to determine the production of biofilm and the presence of icaABCD gene, 30 S. aureus strains isolated from raw milk obtained from cows with subclinical mastitis were analyzed. Biofilm production was determined by the quantitative method on microplates for cell culture and the presence of genes icaABCD by polymerase chain reaction. Biofilm production was observed in 96.67% of strains of S. aureus. These 43.34% were strong producers, 30.00% producing moderate, 23.33% weak producers and 3.33% non producing biofilm. All of the icaABCD genes was obtained at 6.66% of the isolates. All strains, except one, presented icaA or icaD. 56,66% of isolates identified genes icaA/icaD. The icaABCD operon genes were identified in all biofilm-producing strains, which demonstrates that they possess a virulence factor that facilitates its persistence in the breast tissue. In addition, the biofilm is a source of microbial contamination which can lead to failures in production processes that generate problems of food safety.

Keywords: Biofilm; S. aureus; ica genes; raw milk

Introducción

Staphylococcus aureus (S. aureus) es uno de los más importantes agentes causales de mastitis bovina, frecuentemente aislado de leche obtenida de vacas con infección subclínica. La patogénesis de la mastitis estafilocócica se atribuye a una combinación de factores extracelulares y toxinas, aunada con propiedades de la cepa, tales como adherencia y formación de biofilm (1).

La producción de biofilm es considerada un importante factor de virulencia en cepas de S. aureus productoras de mastitis bovina, puesto que, permite la adherencia de las bacterias al epitelio de las glándulas mamarias, facilita la persistencia del microorganismo en el tejido mamario, interfiere en la acción de los agentes antimicrobianos y protege a las células bacterianas de los mecanismos de defensa del hospedero (2,3,4). Diversos autores han demostrado que en el caso de mastitis bovina causada por especies de estafilococos, la capacidad de producir biofim es la razón más importante de las infecciones recurrentes y de problemas inusuales con la erradicación de la infección de las glándulas mamarias (1,2,4).

La expresión de los genes del operón icaABCD es un marcador de virulencia en S. aureus de importancia clínica, tanto en humanos como en animales, puesto que, codifica la producción del polisacárido de adhesión intercelular (PIA), considerado el principal y mejor caracterizado polisacárido constituyente del biofilm en este microorganismo. Según un estudio de Vasudevan y col (5) la presencia de los genes ica en cepas de S. aureus aisladas de mastitis, confirma su rol potencial como factor de virulencia en la patogénesis de la mastitis en bovinos.

La determinación de la formación de biofilm y la investigación de los genes involucrados en la elaboración del PIA, permiten evaluar in vitro estos dos importantes marcadores de virulencia en aislamientos de S. aureus. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue analizar la producción fenotípica de biofilm y detectar la presencia de genes del locus de adherencia intercelular icaABCD, en cepas de S. aureus aisladas de leche cruda obtenida de vacas con mastitis subclínica.

Material y Método

Se analizaron 30 cepas de S. aureus aisladas de leche cruda obtenida de vacas con mastitis subclínica. De estas cepas, 15 provenían de ganado bovino perteneciente a 3 fincas del Municipio Miranda y 15 de 2 fincas del Municipio La Cañada de Urdaneta, ubicados en el Estado Zulia, Venezuela.

Para la determinación de biofilm se utilizó el método cuantitativo sobre microplacas de cultivo celular propuesto por Christensens y col (6), el cual se describe brevemente: las cepas se inocularon CST-glucosado y se incubaron a 35°C ± 2°C 18-24h. A partir del crecimiento se preparó una dilución 1:100 en CST-glucosado y 200 µl se inocularon, por triplicado, en placas de microtitulación. Se utilizó 200 µl de CST-glucosado como control negativo y como control positivo de adhesión S. aureus ATCC 2592. Se incubó en aerobiosis durante 48 horas a 37°C. Luego, los cultivos se decantaron y se lavó tres veces con buffer PBS pH 7.4. El biofilm formado se fijó con acetato de sodio al 2% p/v por 15 minutos y se coloreó con cristal violeta al 1% p/v. Se lavó con agua desionizada y se secó a temperatura ambiente. La cuantificación del grado de producción de biofilm se realizó midiendo la densidad óptica a 630nm de la capa bacteriana adherida a las placas de microtitulación.

Para la extracción de ADN, las cepas de S. aureus se inocularon en caldo soya suplementado con 2% de glucosa y se incubaron a 36 ± 2ºC por 24 horas. Luego, se trasvasó una alícuota de cada cultivo a microtubos y se centrifugó a 14000 rpm por 10 minutos. El sedimento se lavó 2 veces con solución salina fisiológica al 0,8%, mediante centrifugación por 10 minutos a 14000rpm. Posteriormente, al sedimento se le añadió 100 µl de agua destilada estéril, se hirvió por 15-17 minutos, se centrifugó por 10 minutos a 14000rpm. El sobrenadante se trasvasó a un tubo estéril y se conservó a -20°C, hasta su utilización en las reacciones de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (7).

Antes de las reacciones de amplificación de los genes ica, se realizó una PCR previa para verificar la fidelidad del ADN bacteriano, cuyo control se llevó a cabo con los cebadores diseñados por Greisen y col (8), para amplificar el gen

16S rRNA (16s-PLUS 3´-AGGAGGTGATCCAACCGCA-5´ y 16s-Minus 3´AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-5´) y el gen nuc (Forward 3´- AAAGGGCAATACGCAAAGA-5´ y Reverse 3´-TAGCCAAGCCTTGACGAACT-5´), específico para las cepas identificadas bioquímicamente como S. aureus (9). Adicionalmente, se incluyó un control de reacción, que consiste en un tubo conteniendo cada uno de los componentes de la mezcla de reacción, excepto el ADN muestra.

La detección de los genes del operón ica se realizó por PCR utilizando iniciadores específicos para la amplificación de los genes icaA, icaB, icaC (Kiem y col)(10) e icaD (11) (tabla 1). Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 μl conteniendo: 1,5 mM MgCl2, 0,2 μM de cada iniciador; Buffer Taq hasta 1X; 0,2 mM de la mezcla de dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); 4 μl del ADN extraído y 1,25 Unidades de Taq polimerasa.

La separación de los productos de PCR se realizó por electroforesis en geles de agarosa (2% p/v) en presencia de bromuro de etidio (0,5 µg/ml), según lo descrito por Ausbel y col (12). El tamaño de los productos de PCR se determinó según sus migraciones en los geles de agarosa comparándolo con la migración de las bandas de ADN estándar del marcador de peso molecular 100bp DN Ladder.

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS^TM versión 19.0 (SPSS, Inc. Chicago, USA) para Windows^TM. Para establecer si existe alguna relación de asociación entre la formación de biofilm y la presencia de genes icaABCD se utilizó el estadístico de contraste X² (Chi-cuadrado), con un nivel de confianza (α) de 0,05.

Resultados

En la figura 1 se observa la frecuencia y el grado de producción de biofilm según la capacidad de adherencia de los aislamientos en placas de poliestireno. En 29/30; 96,67% cepas de S. aureus evaluadas se observó producción de biofilm de acuerdo con los valores de DO_630nm. De éstas, 13/30 (43,34%) fueron clasificadas como fuertes productoras (DO_630nm entre 0,134-1,420), 9/30 (30,00%) catalogadas como moderadas productoras (DO_630nm entre 0,091-0,132) y 7/30 (23,33%) registradas como débiles productoras (DO_630nm entre 0,045-0,088). Sólo 1/30 (3,33%) de los aislamientos fue clasificado como no productor de biofilm debido a su bajo poder adherente sobre poliestireno (DO_630nm 0,023).

Las figuras 2 y 3, muestran los resultados de la detección de los genes del operón icaABCD en algunas de las cepas evaluadas.

Al analizar los resultados de la identificación de genes del operón icaABCD se comprobó que aunque 96,67% de las cepas estudiadas produjeron biofilm por el método fenotípico, el comportamiento en la evaluación genotípica fue notablemente diferente. Como puede apreciarse en 2/30 (6,66%) cepas se evidenció la presencia de la totalidad de los genes que conforman el operón ica. Sin embargo, cuando se consideró sólo la presencia de los genes icaA o icaD se observó que todas las cepas presentaron uno de estos dos genes, en la mayoria de los casos junto con otros genes. La presencia de los genes icaA/icaD se demostró en 17/30 (56,66%) cepas, en algunos casos acompañados del gen icaB o de los genes icaB/icaC (tabla2).

Discusión

En este estudio 96,67% de los aislamientos de S. aureus produjeron biofilm. Estos resultados coinciden con los obtenidos por varios autores, quienes han evaluado la producción de biofilm en cepas aisladas de leche mastítica. Así, De los Santos y col (13), Peña y Uffo (14) y De Castro y col (15) evaluaron la formación de biofilm en S aureus, provenientes de leche de tanque y leche de vaca con mastitis y obtuvieron entre 98-100% de aislamientos con capacidad de adherencia, utilizando el método cuantitativo sobre placas de cultivo celular. Además, Pereyra y col (16), analizaron el poder de adherencia de S. aureus, clasificados como persistentes y no persistentes, de acuerdo con su permanencia en el tejido mamario y comunicaron 100% de cepas productoras de biofilm en ambos grupos. Milanov y col (17), evaluaron 70 aislamientos de leche mastitíca y todos resultaron productores de biopelículas. De igual modo, Darwish y col (18) estudiaron S. aureus y obtuvieron 100% de cepas con poder de adherencia. Otro grupo de investigadores, Bardiau y col (19), Al-Rubaye y col (20) y Al-Iedani (21), hallaron entre 80-94% de aislamientos recolectados de leche cruda, con capacidad de adherencia sobre placas de poliestireno.

Al contrastar las publicaciones de otros autores con los resultados de esta investigación, se aprecia una notable discrepancia en la frecuencia de producción de biofilm de cepas S. aureus asociadas con mastitis bovina. En este sentido, Oliveira y col (22), caracterizaron como productoras de biopelículas in vitro a 18,75% cepas de S. aureus obtenidas de infecciones intramamarias. Dhanawade y col (23) informaron 29,41% de cepas adherentes relacionadas con mastitis subclínica. Otros autores, Szweda y col (24), Begum y col (25), Fox y col, (3), Vasudevan y col (5), recuperaron entre 40-67% especímenes de capacidad de adherencia a partir de muestras de leche.

En este estudio 13/30 (43,34%) cepas de S. aureus resultaron fuertes productoras, resultados similares han sido comunicados por Peña y Uffo (14), 40,8% y Darwish y col (18), 52,57%. En contraste, otros autores Begum y col (25), Milanov y col (17), Bardiau y col (19) indican una mayor recuperación de aislamientos moderados y débiles productores de biofilm.

Es notable la variabilidad que se observa en los estudios publicados a nivel mundial donde se analiza la producción fenotípica de biofilm y la presencia de genes ica, en cepas de S aureus aisladas de muestras de leche de bovinos con mastitis clínica y subclínica. La mayoría de las publicaciones evalúa los genes icaA e icaD, cuya presencia se relaciona directamente con la capacidad del microorganismo de producir el PIA, principal componente de la sustancia polimérica extracelular del biofilm (11,16,24).

Los resultados de esta investigación discrepan con los obtenidos por Vasudevan y col (26), Szweda y col (24), Melchior y col (4), quienes reportan la presencia de genes icaA e icaD en la totalidad de las cepas de S aureus aisladas de muestras de leche mastítica; sin embargo indican porcentajes de producción de biofilm que oscilan entre 57,6 y 97,5%. En otra investigación realizada por Melo y col (26), en Brasil, en la cual evaluaron cepas aisladas de vacas lecheras con mastitis subclínica, comunicaron un elevado porcentaje de cepas positivas para icaA/icaD y producción de biofim, 95,7% y 98,9%, respectivamente.

En contraste, otros autores encuentran resultados comparables con los obtenidos en esta investigación, en los cuales las cepas aisladas presentan una alta producción de biofilm por el método cuantitativo sobre microplacas de cultivo celular, que oscila entre 80-100%, pero no así para la amplificación de los genes icaA/icaD. De este modo, Marques y col en sus investigaciones (27, 28), al caracterizar feno-genotípicamente cepas de S aureus obtenidas de bovinos con infección intramamaria subclínica, recuperaron entre 81,6-100% de productoras de biofilm y entre 63,2-80% con genes icaA/icaD. Además, Darwish y col (18), en un estudio en el cual se evaluó 108 muestras de leche de vacas con mastitis subclínica demostraron 100% de formación de biofilm; sin embargo sólo 62,5% de las cepas presentaron el gen icaD, mientras que la recuperación de icaA fue muy baja (15%).

Otros investigadores han comunicado porcentajes de recuperación de genes icaA/icaD notablemente inferiores a los obtenidos en este estudio. Coehlo y col (29) analizaron 50 cepas de S aureus obtenidas de leche mastítica e informaron 80% de producción fenotípica de biofilm, aunque la demostración de amplificación de los genes icaA e icaD solo fue posible en 14% y 12%, respectivamente. Estos autores han propuesto que la falta de correlación entre la formación de biofilm y la demostración de productos de amplificación del locus icaABCD, podría deberse a la coexistencia de otros mecanismos de producción de biofilm en esta bacteria. En efecto, O’Gara (30) ha indicado que las delecciones en el operón ica no impiden la formación de biofilm, destacando la existencia de un mecanismo alternativo mediante el cual S. aureus expresa una variedad de adhesinas que le permiten unirse y colonizar diferentes superficies.

Para evaluar la asociación entre la producción de biofilm y la presencia de genes ica en las cepas de S. aureus estudiadas, se aplicó la prueba estadística chicuadrado. El valor p (>0,05) obtenido indica que no existe relación de dependencia entre las variables analizadas, es decir, que en estos aislamientos la formación de biofilm es independiente de los genes ica que codifican las proteínas para la síntesis del PIA. A pesar del papel que se le atribuye al PIA como principal exopolisacárido de la matriz del biofilm, Cucarrela y col (2), han propuesto que, además del locus ica, la producción de biofilm en S aureus también puede estar mediada por el gen bap (proteína asociada a biofilm) que codifica una proteína que promueve tanto la fijación inicial como la adhesión intercelular.

Un elevado porcentaje de las cepas de S aureus analizadas en este estudio fueron capaces de producir biofilm y portan genes del locus icaABCD, con lo cual se evidencia que las cepas aisladas a partir de leche cruda proveniente de vacas con mastitis subclínica, están dotadas de un importante factor de virulencia que facilita su adherencia y permanencia en el tejido mamario, promoviendo la persistencia de la infección intramamaria en el ganado productos de leche.

La elevada producción de biopelículas en las cepas de S aureus analizadas no solo debe ser considerada por su importancia en la patogénesis de la mastitis bovina; sino también, en la industria láctea donde la formación de biofilm constituye una fuente potencial de contaminación microbiana de las líneas de procesamiento de alimentos, lo cual puede conducir a fallas en los procesos de producción que generen problemas de inocuidad de los alimentos y la potencial transmisión de enfermedades.

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