Producción de Enterotoxina y Biofilm en Aislamientos Clínicos de Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina

Enterotoxin and Biofilm Production in Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

Ávila R, Yeiny(1); Ginestre P, Messaria(1*); Valero L, Kutchynskaya(2); Castellano G, Maribel(1); Romero A, Sonia(1); López, Alfredo(3); Rincón V, Gresleida(2); Sandrea T, Lisette(4)

(1)Bacteriología General. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela. (2)Bacteriología Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela. (3)Cirugía Cardiovascular. Hospital Universitario de Maracaibo-Venezuela. (4)Práctica Profesional de Bacteriología. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela.

*Autor de Correspondencia> Messaria Ginestre. e-mail: messaria@hotmail.com

Recibido: 08-07-14 / Aceptado: 27-10-14

Resumen

S. aureus se ha convertido en un problema de salud pública, debido a la dificultad que representa el tratamiento de las infecciones causadas por SARM. El propósito de esta investigación fue determinar la producción de enterotoxinas A, B, C y D y la producción de biofilm en aislamientos de SARM. Se estudiaron 50 cepas aisladas de diferentes tipos de muestras clínicas. La detección de enterotoxinas se realizó por la técnica de aglutinación en fase reversa y la producción de biofilm mediante: agar rojo congo y el método en microplacas de cultivos celulares. La producción de enterotoxina se observó en 9 cepas (18%), siendo la enterotoxina D (64%) la más prevalente, seguida de la B (27%) y la A (9%). Se demostró una asociación significativa entre la producción de enterotoxina y el tipo de muestra de la que provenía la cepa. La producción de biofilm se constató en 30% y 98% de las cepas por los métodos de agar rojo congo y microplacas de cultivos celulares, respectivamente; sólo en 15 cepas (30%) se observó correlación de ambos ensayos, se demostró que el método en microplacas de cultivo celular es más eficaz para detectar la producción de biofilm en S. aureus.

Palabras clave: S. aureus resistente a meticilina, Enterotoxinas, Biofilm.

Abstract

S. aureus has become a public health problem, due to the difficulty of treating infections caused by methicillin-resistant S. aureus (MRSA). The purpose of this research was to determine the production of enterotoxins A, B, C and D and the production of biofilm in clinical isolates of MRSA. Fifty MRSA strains isolated from different types of clinical samples were studied. Detection of enterotoxins was carried out using the technique of reversed phase agglutination, while biofilm production was studied through two tests: Congo red agar and the microplate cell culture method. Enterotoxin production was observed in 9 strains (18%); enterotoxin D (64%) was the most prevalent, followed by B (27%) and A (9%). A significant association was shown between enterotoxin production capacity and the type of sample that came from the strain. Biofilm production was found in 30% and 98% of the strains using the Congo red Agar and microplate cell culture methods, respectively. A correlation of both trials was observed in only 15 strains (30%). It was shown that the microplate cell culture method is more effective for detecting biofilm production in S. aureus strains.

Keywords: Methicillin-resistant S. aureus, enterotoxins, biofilm.

Introducción

Staphylococcus aureus (S. aureus) es una importante causa de infecciones adquiridas tanto en el hospital como en la comunidad que constituye un problema creciente de salud pública, debido a la dificultad que re- presenta el tratamiento de las infecciones causadas por este microorganismo, teniendo en cuenta la incidencia creciente de S. aureus resistente a meticilina (SARM) y, más recientemente, la aparición de resistencia a glucopéptidos (1).

El alto grado de patogenicidad de S. aureus está relacionado con la importante producción de enzimas extracelulares que permiten la penetración e invasión de los diferentes tejidos (coagulasa, proteasas, metaloproteasas, hialuronidasas, lipasas y fosfolipasa C). Otros compuestos permiten la adherencia, como son las proteínas de unión a fibronectina, la colagenasa y diversos factores de agregación. Su persistencia sobre todo en materiales sintéticos (catéteres), está predominantemente inducida por diferentes polisacáridos de adhesión que favorecen la producción de biofilm. Entre las toxinas conocidas destacan las hemolisinas, las diferentes enterotoxinas, la toxina exfoliativa, la toxina del síndrome de choque tóxico (SSTT), otros superantígenos estafilocócicos y finalmente las leucocidinas (2, 3).

Las enterotoxinas estafilocócicas (SE) constituyen un grupo de proteínas extracelulares de cadenas simples, con bajo peso molecular (26 a 30kDa). Están codificadas por elementos genéticos móviles, como plásmidos, bacteriófagos o islas de patogenicidad, que facilitan la diseminación horizontal entre poblaciones bacterianas (4, 5). Son hidrosolubles y resistentes a la acción de enzimas proteolíticas como la pepsina y tripsina, permaneciendo activas después de la ingestión (4). Hasta la fecha, se han descrito 20 tipos diferentes de enterotoxinas, que pueden dividirse en dos grandes grupos: 1) las SEs con actividad enterotóxica y emética reconocida; que comprenden las SEs clásicas: SEA, SEB, SEC (con cinco variantes antigénicas: C₁, C₂, C₃, C_bovina y C_ovina), SED, SEE y las SEs G-J; y 2) el grupo de las toxinas similares a enterotoxinas de estafilococos, conformada por 11 toxinas (6).

Las enterotoxinas de S. aureus se unen a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) y a la región variable de las cadenas B de los linfocitos T; esta interacción da lugar a la estimulación masiva de linfocitos T y producción de grandes cantidades de interleucina 2 que al llegar al torrente circulatorio producen una variedad de síntomas como náuseas, vómitos y fiebre (7). Además de la enfermedad aguda, los estafilococos son reconocidos como causa frecuente de infecciones asociadas a la producción de biofilm. Esta condición excepcional se debe a que los estafilococos son bacterias comensales frecuentes en la piel y mucosas humanas, capaces de colonizar cualquier dispositivo médico que penetre esas superficies (8).

La producción de biofilm se convierte en un problema de gran impacto en las industrias alimentarias, ambientes hospitalarios y comunitarios en general, ya que se producen en una gran variedad de superficies de contacto que involucra alimentos, tejidos animales con propósito alimenticio o no, tejidos humanos, prótesis, superficies de procesamiento en industrias, entre otros; causando en estos ambientes grandes inconvenientes, tales como: infecciones persistentes, fracaso en tratamientos terapéuticos, fracaso en aseguramiento de alimentos inocuos y en los peores casos pérdidas humanas. Por tanto, surge la necesidad de erradicar los biofilms y sus agentes etiológicos en estos ambientes; ya que su presencia se traduce en grandes pérdidas económicas en las industrias y pérdidas humanas en ambientes clínicos (9, 10).

El propósito de esta investigación fue determinar fenotípicamente la producción de enterotoxinas A, B, C y D y la capacidad de producción de biofilm de 50 aislamientos de SARM obtenidos de diferentes tipos de muestras clínicas.

Material y Método

Se estudiaron 50 cepas de SARM aisladas de diferentes tipos de muestras clínicas provenientes de pacientes del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM). A todas las cepas se les determinó la producción de enterotoxinas A, B, C y D mediante la técnica de aglutinación en fase reversa SET-RPLA, Oxoid®; así como también, la capacidad de producción de biofilm, a través de dos ensayos fenotípicos: Cultivo sobre agar rojo congo (ARC) (11) y un ensayo fenotípico cuantitativo: microplacas de cultivos celulares (TCP) (12).

Los datos obtenidos fueron analizados de forma porcentual y organizados en tablas y gráficos. La asociación entre la producción de enterotoxina y el tipo de muestra clínica de la cual provenían las cepas enterotoxigénicas, se determinó mediante la aplicación del estadístico 2 con un grado de confiabilidad del 95%. Se empleó el Software estadístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versión 19.

Resultados

La determinación de enterotoxinas A, B, C y D en las 50 cepas de SARM, utilizando el método de aglutinación en fase reversa arrojó los siguientes resultados: en 9 aislamientos se detectó la producción de enterotoxina, representando esto un 18% de positividad.

De los 9 aislamientos de SARM enterotoxigénicos, 7 (78%) produjeron sólo una enterotoxina y en 2 (22%) se observó coproducción de dos tipos de enterotoxinas.

La distribución de los tipos de enterotoxinas encontrados en esta investigación se muestra en la Figura 1 No se detectó enterotoxina tipo C en ninguna de las cepas estudiadas. Cabe resaltar, que en dos aislamientos (22%), se evidenció la coproducción de enterotoxina B y D (datos no mostrados).

Los 50 aislamientos de SARM estudiados en esta investigación procedían de diferentes tipos de muestras clínicas de pacientes del SAHUM. Los resultados obtenidos en la determinación de enterotoxinas según el tipo de muestra clínica se observan en la Tabla 1. Puede observarse que, del total de cepas positivas, el mayor porcentaje de aislamientos enterotoxigénicos provenía de muestras de diferentes tipos de secreciones (heridas, oculares y úlceras).

La interpretación de las colonias sobre el ARC se realizó utilizando la escala colorimétrica propuesta por Arciola et al (13); para lo cual se diferenciaron 5 tipos de colonias: colonias muy rojas (MR), colonias rojas (R), colonias marrones (M), colonias negras (N) y colonias muy negras (MN); clasificándose como cepas fuertemente productoras de biofilm aquellas que mostraron colonias negras y muy negras, débilmente productoras las que presentaron colonias marrones, mientras que, la presencia de colonias rojas y muy rojas correspondieron a cepas no producto- ras de biofilm.

Entre las cepas de SARM estudiadas se evidenciaron fenotipos productores de biofilm, al observarse colonias muy negras, negras y marrones sobre las placas de ARC después de 48 horas de incubación: 15 (30%) cepas de SARM resultaron positivas a la producción de biofilm a través de este método (Figura 2).

La diversidad y frecuencia de las colonias observadas sobre ARC se muestra en la figura 3. Puede notarse que las 35 (70%) cepas de SARM no productoras de biofilm, desarrollaron colonias rojas y muy rojas en el medio ARC; mientras que, los aislamientos productores de biofilm 15 (30%) mostraron colonias marrones, negras y muy negras.

En las figuras 4 y 5 se observa la distribución y frecuencia de producción de biofilm en las 50 cepas estudiadas, de acuerdo al grado de adherencia a las placas de poliestireno: Los aislamientos de SARM cuyos valores de densidad óptica (DO) oscilaron entre 0,080 y 0,155 fueron clasificados como débil productores de biofilm, las cepas con niveles de DO entre 0,161 y 0,222 resultaron moderadamente productoras de biofilm y los aislamientos con DO entre 0,279 y 0,612 se cata- logaron como fuertemente productores de biofilm. Una cepa fue clasificada como no productora de biofilm por su bajo poder adherente al poliestireno (DO 0,073).

Al comparar los resultados obtenidos en ambos métodos fenotípicos, ARC y TPC (Tabla 2), puede observarse que solo hubo correlación en 15 (30%) cepas de SARM, que resultaron positivas para la formación de biofilm a través de los dos métodos utilizados; mientras que, 34 cepas que fueron positivas por la técnica TPC no mostraron fenotipos formadores de biofilm en ARC y sólo un aislamiento fue negativo por ambos métodos.

Discusión

El porcentaje de positividad para detección de enterotoxinas en las cepas de SARM evaluadas fue de 18%. Este resultado difiere de lo reportado por diversos autores en la literatura; así, Coia et al. (14) informaron 55,51% de aislamientos productores de enterotoxinas en cepas de S. aureus resistentes y sensibles a meticilina (SASM). Por su parte, Humphreys et al. (15), al estudiar 79 cepas de S. aureus (52 aisladas de casos de septicemia y 27 de portadores nasales) reportaron 45,6% de cepas enterotoxigénicas, destacando que 9 cepas de casos de septicemia eran resistentes a meticilina y todas fueron productoras de enterotoxina (5: SEA y SEB; 2: sólo SEA y 2: sólo SEB).

De igual manera, Fueyo et al. (5) y Boynukara et al. (16) reportan porcentajes de producción de enterotoxinas en aislamientos clínicos de S. aureus, que oscilan entre 29- 84%; mientras que, Al Bustan et al. (17) y Mehrotra et al. (18), informaron entre 34- 87% de positividad en cepas aisladas de portadores asintomáticos.

Diversos autores reportan la enterotoxina A como la más frecuentemente expresada en aislamientos de S. aureus provenientes de muestras clínicas humanas, lo cual difiere de lo observado en el presente estudio, donde la enterotoxina más frecuente fue la enterotoxina D (64%). Así, Coia et al. (14), al comparar la producción de enterotoxinas y hemolisinas en SARM y SASM, informaron 89% de cepas de SARM productoras de SEA, seguida de 26% para SEC, 22% SEB y no se encontró ninguna cepa productora de SED. Fueyo et al. (5) reportan 29% de cepas enterotoxigénicas de S. aureus aisladas de muestras clínica y de estas 14 fueron positivas para SEA, 10 para SEC, 2 para SEB, 2 para SED, 1 para SEA + SEC y 4 para SEC + SED.

Humphreys et al. (15), al estudiar la producción de enterotoxinas en cepas de S. aureus aisladas de pacientes con septicemia y de portadores sanos observaron, en forma general, la producción de SEA en 42% de los aislamientos estudiados, seguido de 44% de SEC, 36% SED y 31% SEB; sin embargo, es importante mencionar que, de los aislamientos provenientes de los portadores sanos,

sólo 3 resultaron enterotoxigénicos y todos produjeron SED. Asimismo, Boynukara et al. (16), informaron que de 46 cepas de S. aureus, 85% presentaron SEA, 7% SEB, 4% SEC y 4% SED.

De igual manera, otra investigación donde se determinó la presencia de genes que codifican la producción de enterotoxinas clásicas (SEA-SED) y otras de reciente aparición, en aislamientos de S. aureus provenientes de manipuladores de alimentos, se reporta al gen sea, el cual codifica la producción de SEA, como el más frecuentemente identifica- do (Rall et al. (19). Sin embargo, Sila et al. (20) y Avanish et al. (21) informan el gen sed, que codifica la producción de SED, como el más prevalente dentro de los genes de las SE clásicas.

En este estudio 78% de las cepas fueron monoproductoras de enterotoxinas y en 22% se observó coproducción de dos tipos de enterotoxinas (SED y SEB). Este resultado es similar a lo reportado por Coia et al. (14), quienes informan un 74% de aislamientos de S. aureus monoproductores de enterotoxina y un 26% de cepas con coproducción (2 o más enterotoxinas). Humphreys et al. (15), informan porcentajes diferentes de cepas de S. aureus productoras de un solo tipo de enterotoxina (52%) y cepas con producción simultánea de enterotoxinas (48%). Sin embargo, el patrón de combinación de enterotoxinas observado en el presente estudio (SEB y SED) no coincide con los reportados por los auto- res mencionados. Además, Fueyo et al. (5), reportan cepas enterotoxigénicas de S. aureus con patrones de coproducción (SEA + SEC y SEC + SED) diferentes al observado en esta investigación. Por otra parte, Boynukara et al. (16), al determinar la producción de enterotoxina en 55 cepas de S. aureus, no encontraron producción simultánea de 2 o más enterotoxinas en una misma cepa.

Al evaluar la relación entre la producción de enterotoxina y el origen de la cepa, se evidencia que el mayor porcentaje de aislamientos enterotoxigénicos provenía de diferentes tipos de secreciones (heridas, oculares y ulceras). Al aplicar el estadístico 2 se demostró una asociación significativa (p<0,05) entre la producción de enterotoxina y los aislamientos provenientes de muestras de secreciones. No obstante, otras investigaciones muestran una mayor prevalencia de cepas de S. aureus productoras de enterotoxinas derivadas de muestras de sangre (15, 16).

Las variaciones en los resultados del presente estudio y las observadas en otras investigaciones sobre la ocurrencia de cepas enterotoxigénicas de S. aureus, aisladas de muestras clínicas, pueden deberse a las variaciones geográficas y metódicas. En las últimas décadas, Letertre et al. (22), describieron nuevos tipos de enterotoxinas (SEG–SEU), pero en este estudio no se investigó la presencia de estos tipos, ya que el equipo RPLA® no incluye antisueros para detectar estas nuevas enterotoxinas, sólo las clásicas SEA, SEB, SEC y SED.

Los biofilms son comunidades microbianas que constituyen la forma más exitosa de colonización entre los microorganismos, son ubicuos en la naturaleza y responsables de una gran variedad de procesos infecciosos que responden escasamente a los tratamientos antimicrobianos (23). Mientras que, las infecciones agudas pueden ser eliminadas con un breve tratamiento anti- microbiano, las infecciones por biofilm, normalmente, no consiguen ser completa- mente eliminadas y producen episodios recurrentes, como consecuencia de que las bacterias del biofilm puede ser hasta 1.000 veces más resistentes a los antibióticos que esas mismas bacterias creciendo en forma plactónica (24, 25).

Entre las enfermedades infecciosas en las cuales se ha logrado una asociación directa con la producción de biofilm se encuentran: otitis media, endocarditis, neumonía, periodontitis, caries dental, ostiomielitis e infecciones asociadas con dispositivos médicos, entre otros. Los principales microorganismos asociados con estos procesos incluyen Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, bacterias anaerobias como Fusobacterium y Porphyromonas, entre otras (23),

El Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos publicó recientemente que más del 60% de todas las infecciones microbianas son causadas por biofilms, de igual manera se les atribuye el 60% de las infecciones nosocomiales; incrementando la estancia hospitalaria, los costos de atención y la mortalidad (26).

La escala colorimétrica propuesta por Arciola et al. (13) para caracterizar la producción fenotípica de biofilm en ARC mostró 30% de positividad para las cepas SARM estudiadas. Este resultado es comparable con lo reportado por Seza et al. (27), quienes al estudiar 129 cepas de S. aureus aisladas de muestras clínicas informaron 22,5% de cepas productoras de biofilm. Otras investigaciones realizadas por Bose et al. (28), Diemond et al. (29) y Mathur et al. (30), en cepas de Staphylococcus spp, donde se determinó la capacidad adherente a través del método del ARC, informan porcentajes de positividad que oscilan entre 16-73%.

La evaluación de la capacidad de adherencia de las cepas estudiadas a través del método sobre placas de microtitulación, mostró diferentes grados de adhesión en el 98% de los aislamientos. No obstante, la literatura consultada indica que existe una gran variabilidad en la capacidad de adhesión de los aislamientos clínicos de S. aureus; de tal modo que, los reportes de Smith et al. (31), Sánchez et al. (32), Bekir et al. (33); Rasha et al. (34) y Gamal et al. (35), indican porcentajes de adhesión en placas de microtitulación que oscilan entre 43-100%

En este estudio se observó una correlación de 30% en la producción de biofilm por los dos métodos fenotípicos, ARC y TPC. El estudio de Rasha et al. (34) muestra resulta- dos similares al encontrar una correlación de 20% entre estos dos métodos. Una muy baja correspondencia entre ambos métodos (5,2%) fue demostrada por Marthur et al. (30). No obstante, una mejor correlación entre ambos métodos fue reportada Cafiso et al. (36), quienes reportaron que todos los Staphylococcus positivos por una prueba fueron también positivos por la otra.

Al comparar los métodos fenotípicos empleados en esta investigación para determinar la capacidad de las cepas de SARM para la formación de biofilm, el ARC, aunque es un método rápido y fácil de realizar tiene la desventaja de la subjetividad al observar los diferentes tipos de colonias que se desarrollan sobre este medio de cultivo; mientras que, el TPC sigue siendo una mejor opción para el estudio de producción de biofilm, tal como lo han sugerido otros autores (30, 34).

En conclusión, en las cepas estudiadas la capacidad de producción de enterotoxinas y la alta frecuencia de producción de biofilm, independientemente de su origen, llama la atención sobre el peligro potencial que representan, lo cual es más relevante tratándose de cepas resistentes a meticilina, puesto que estas cepas por si solas constituyen un problema de salud pública dada la dificultad que representa el tratamiento de infecciones causadas por este tipo de microorganismo.

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